鄭祖亮，方連英，趙 輝，杜 剛*

（天津商業(yè)大學 生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

葡萄酒發(fā)酵是一個復雜的生理生化過程，涉及不同種屬的酵母菌和細菌。葡萄汁中含有許多不同種屬的酵母，其中僅釀酒屬（Saccharomyces）酵母負責乙醇發(fā)酵，并且它的次級代謝產(chǎn)物（如酯類、醛類、酮類、醇類和萜烯類等）是葡萄酒香氣的主要來源，其發(fā)酵性能嚴重影響葡萄酒的質(zhì)量[1]。研究表明，低溫（10～15 ℃）發(fā)酵影響釀酒酵母代謝產(chǎn)物組成，促進葡萄酒芳香化合物的合成，被廣泛應用于葡萄酒釀造業(yè)[2]。然而，低溫發(fā)酵也存在一些危害，如漫長的發(fā)酵周期、遲緩的發(fā)酵速率，甚至是中止發(fā)酵。對釀酒酵母進行低溫篩選、改造，以提高其低溫耐受性是解決這一工業(yè)難題的關(guān)鍵。因此，國內(nèi)外學者一直把釀酒酵母響應低溫脅迫的耐受機制作為研究的重點，以便為選育優(yōu)良釀酒酵母提供理論指導。本文主要介紹了不同釀酒酵母在低溫條件下基因差異性表達、生理特性變化以及低溫識別和響應機制的研究進展，旨在為更好的研究釀酒酵母低溫耐受機制提供一定的參考。

1 低溫脅迫對釀酒酵母的影響

在葡萄酒發(fā)酵過程中，低溫（10～15 ℃）不僅會減緩釀酒酵母的新陳代謝，延長發(fā)酵周期，還會影響乙醇、甘油和其他次級代謝產(chǎn)物的合成[3]。GAMERO A等[1-2]分析比較13種商業(yè)釀酒酵母分別在28 ℃和12 ℃發(fā)酵周期和代謝產(chǎn)物的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12 ℃時它們的發(fā)酵周期均在14～25 d，與28 ℃相比延長了2～3倍；然而在這兩個溫度條件下，糖的消耗量基本相同，主要代謝物（乙醇和甘油）的合成量沒有顯著性差異（P＜0.05），但是芳香化合物的合成量卻存在巨大差異，乙酯類更易在12 ℃合成，高級醇和醋酸酯類卻恰好相反。另外，低溫還影響酵母細胞RNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低細胞膜的流動性、蛋白質(zhì)的翻譯率和折疊速率，導致錯誤折疊蛋白的積累、酶的失活、營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運速率和細胞繁殖速率的降低，甚至使細胞處于休眠狀態(tài)[4]。盡管低溫對葡萄酒發(fā)酵造成一定的危害，但是又促進了葡萄酒中乙酯、萜烯類物質(zhì)的合成，降低高級醇和醋酸酯類的含量，增加葡萄酒的香氣。

2 釀酒酵母對低溫脅迫的應激反應

從基因組和轉(zhuǎn)錄組學等方面分析比較不同種屬（嗜溫和嗜冷）釀酒酵母響應低溫脅迫的差異性變化，發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄表達、翻譯效率和脂質(zhì)的組成存在顯著性差異。這些變化與低溫耐受性密切相關(guān)。

2.1 脂質(zhì)組成與低溫耐受性

生物膜是細胞內(nèi)部環(huán)境與外部環(huán)境的第一層屏障。當酵母細胞處于低溫環(huán)境時，細胞膜的物理特性首先受到影響，如降低細胞膜流動性。研究表明，增加細胞膜中不飽和脂肪酸和中鏈脂肪酸脂質(zhì)的含量，可提高細胞膜的流動性，并且這些脂質(zhì)含量的高低與酵母適應低溫生長密切相關(guān)[2-5]。分析釀酒酵母在低溫下脂質(zhì)組成變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12 ℃條件下中鏈脂肪酸、三酰甘油、固醇酯和鯊烯的含量普遍升高，而長鏈脂肪酸、磷脂酸的含量和卵磷脂/磷脂酰乙醇胺的比例均降低[6]。另外，利用基因工程技術(shù)，將與脂質(zhì)合成相關(guān)基因做敲除或高表達處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，涉及磷脂（PSD1和OPI3）、甾醇（ERG3和IDI1）和鞘磷脂（LCB3）途徑的基因，其缺失嚴重損害低溫環(huán)境下酵母細胞的生長繁殖，而它們的高表達菌株卻幾乎使生長周期縮減了一半，提高了發(fā)酵速率[7-8]。

2.2 基因的轉(zhuǎn)錄表達和翻譯效率與低溫耐受性

TRONCHONI J等[9]利用基因芯片技術(shù)分別研究嗜溫釀酒酵母（S.cerevisiae）和嗜冷釀酒酵母（S.kudriavzevii）（兩者之間86%的基因序列相似）在28 ℃和12 ℃全基因組轉(zhuǎn)錄表達差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S.cerevisiae的177個基因被上調(diào)和194個基因被下調(diào)，而S.kudriavzevii的分別為160個和128個，兩者之間無較大差別；然而它們的基因轉(zhuǎn)錄水平卻存在顯著性差異，12 ℃條件下S.kudriavzevii的231個基因被高表達，而S.cerevisiae只有78個；此外，在12 ℃下經(jīng)過巴龍霉素（蛋白質(zhì)翻譯抑制劑）處理后，S.cerevisiae的生長受到嚴重抑制，而S.kudriavzevii幾乎不受影響，在28 ℃下的恰好相反。這表明S.kudriavzevii的耐受低溫特性是由于低溫環(huán)境下基因的轉(zhuǎn)錄表達量和蛋白質(zhì)的翻譯效率被提高。

3 釀酒酵母對低溫脅迫的響應機制

圖1 釀酒酵母低溫信號通路示意圖[10]Fig.1 Schematic diagrams of the low temperature signal pathways in S.cerevisiae

信號轉(zhuǎn)導途徑與環(huán)境刺激所引起的細胞應答反應密切相關(guān)。在真核細胞中最常見的信號轉(zhuǎn)導途徑是促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase cascades，MAPKs）級聯(lián)，通過連續(xù)的磷酸化傳遞信號，激活相應的細胞應答。在釀酒酵母中有五個核心MAPKs：Hog1p、Slt2p、Fus3p、Kss1p和Smk1p，分別調(diào)控高滲透性甘油合成（the high osmolarity glycerol pathway，HOG）、細胞壁完整性（the cell wall integrity pathway，CWI）、細胞繁殖、菌絲生長和產(chǎn)孢途徑[10]。研究表明，低溫耐受性與HOG、CWI、環(huán)磷酸腺苷活化蛋白激酶A（the cAMP-activated protein kinase A pathway，cAMP-PKA）和雷帕霉素信號級聯(lián)（the target-ofrapamycin signaling pathway，TOR）途徑密切相關(guān)（見圖1）。

3.1 HOG途徑對低溫信號的識別與轉(zhuǎn)導

HOG途徑是釀酒酵母維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡以適應外界高滲環(huán)境的信號轉(zhuǎn)導途徑，由兩個上游滲透壓感應受器（Sln1-Ypd1-Ssk1和Sho1分支）和下游MAPK級聯(lián)系統(tǒng)組成（如圖1）。脅迫信號由Sln1-Ypd1-Ssk1和/或Sho1分支傳遞到Pbs2p MAPKK，激活Hog1p MAPK?；罨腍og1p MAPK進入細胞核調(diào)控一系列的轉(zhuǎn)錄因子，如Sko1p、Smp1p、Hot1p、Msn2p/Msn4p等，進而調(diào)控一系列相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，以適應外界環(huán)境的變化[11]。

HOG途徑中，基因Sho1突變體對低溫脅迫不敏感，而基因Ssk1突變體對低溫脅迫敏感，此外基因Hog1突變體會損害海藻糖合成酶基因、甘油合成酶基因和小分子伴侶的表達，進而影響酵母細胞的正常生長[12]?；騉le1、Tip1和Nsr1由活化的Hog1p MAPK獨立誘導，它們的轉(zhuǎn)錄表達促進了胞內(nèi)甘油的合成和積累，以保護細胞免受低溫損傷[13]。由此可知，HOG途徑是釀酒酵母響應低溫脅迫的一種應激方式，且低溫信號由Sln1-Ypd1-Ssk1分支所識別。

3.2 釀酒酵母CWI途徑對低溫信號的識別與轉(zhuǎn)導

CWI途徑具有調(diào)控基因表達、蛋白質(zhì)合成、細胞骨架維護、DNA修復和細胞代謝等功能[14]。典型的CWI途徑由細胞壁完整性和應激反應元件家族（wall integrity and stress response component，Wsc）、Pkc1p MAPKKKK、Bck1p MAPKKK、Mkk1p/Mkk2p MAPKK和Slt2p MAPK組成（如圖1）。CWI途徑不僅修復由化合物、氧化和熱休克所造成的細胞壁損傷[15]，而且響應低溫脅迫。

CWI途徑中，Wsc1p是最重要的低溫信號識別元件。12 ℃條件下，Wsc1突變體降低Slt2p的磷酸化水平，影響酵母細胞的正常生長，而在Wsc2/Wsc3雙突變體中此缺陷更加明顯。另外，缺少Rom1p或Rom2p（Pkc的兩個上游效應器）、Bck1p、Mkk1p/Mkk2p或Slt2p都嚴重影響低溫條件下酵母細胞的生長繁殖[16-17]。由此可知，CWI途徑對響應低溫脅迫有著重要作用。然而，讓人不解的是Slt2p的磷酸化完全依賴于Bck1p，而Bck1突變體經(jīng)熱處理后仍然能夠激活Slt2p[18]。低溫信號是如何從Wsc1p-3p傳遞到MAPK模塊，此過程是否只依賴Bck1p和Pkc1p傳遞信號，這些理論機制目前尚不清楚。

3.3 各轉(zhuǎn)導途徑相互協(xié)調(diào)以響應低溫脅迫

在長期的進化過程中，真核生物形成了一系列非常保守的生理適應機制。這些機制不僅獨立響應環(huán)境脅迫，而且大多數(shù)情況下是以相互協(xié)調(diào)的方式對外界環(huán)境變化做出應答。

CWI途徑中，Slt2p的激活可能需要額外脅迫信號的輸入，并且需要其他效應器或MAPK信號途徑的介導[15]。有趣的是，Hog1p MAPK的磷酸化峰在低溫處理5 min左右出現(xiàn)，而Slt2p MAPK的活化峰出現(xiàn)在120～180 min之間，這說明CWI途徑不能直接感知低溫信號，而是通過其他MAPK途徑引發(fā)的二次效應[19]。另外，HOG途徑中的Sho1分支對于CWI途徑響應酶解酶脅迫是必不可少的[20]，也有證據(jù)表明HOG和CWI途徑并不相互排斥[21]，它們之間相互協(xié)調(diào)，共同響應低溫脅迫。遺憾的是，目前并沒有直接證據(jù)表明CWI途徑是由Hog1p信號激活的。

TOR和cAMP-PKA途徑是酵母細胞調(diào)控營養(yǎng)生長的主要元件[22-23]。這兩個途徑中各元件基因的突變體在低溫下都顯示生長缺陷。如Torc1（編碼TOR激酶復合物I）或Ira2（cAMP-PKA途徑的負調(diào)控因子）突變體對低溫敏感，而Ras2突變體會促進低溫條件下細胞的生長[17，24]。CWI途徑中Slt2p 的激活導致Torc1p 失活，間接抑制Sch9p（TORC1信號轉(zhuǎn)導的下游靶點）的活化[22]，并直接激活Bcy1p，隨之降低PKA的活性[25]。CWI-TOR-cAMP-PKA途徑之間似乎有著密切的關(guān)聯(lián)，并且Slt2p對協(xié)調(diào)各途徑以適應低溫環(huán)境發(fā)揮著重要作用。

4 展望

Saccharomyces是葡萄酒釀造的主要微生物，提高其低溫耐受性不僅保證低溫發(fā)酵過程中具有良好的繁殖能力和發(fā)酵活性，還可促進芳香化合物的合成，提高葡萄酒的品質(zhì)和產(chǎn)量。目前，對不同種屬釀酒酵母低溫耐受性做了大量研究，發(fā)現(xiàn)了許多與低溫適應性相關(guān)的新途徑，例如氧化還原酶和維生素合成途徑，以及氨基酸代謝等[26-27]；以及利用基因工程對商業(yè)釀酒酵母（QA23，Lallemand Inc）進行改造，基因Csf1、Hsp104和Tir2等的過表達菌株不僅縮短了低溫生長周期，還提高了發(fā)酵速率。盡管如此，釀酒酵母耐受低溫的理論機制仍不清楚，基因工程改良菌株也僅停留在實驗室階段。隨著基因組學、轉(zhuǎn)錄組學等技術(shù)的發(fā)展，相信越來越多的未知功能基因?qū)话l(fā)現(xiàn)，釀酒酵母低溫耐受性的理論機制也將更加清晰。這將指導獲取低溫耐受性的新型釀酒酵母以及形成新的策略提高葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)量和質(zhì)量，以此解決葡萄酒低溫發(fā)酵所面臨的種種困難。

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