鄭曉吉，史學偉，許程劍，董 娟，倪永清*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832003）

酵母菌作為一類重要的微生物資源，在食品、醫(yī)藥、發(fā)酵工業(yè)、環(huán)保等行業(yè)被廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌的營養(yǎng)代謝極其多樣，在自然界不同的微環(huán)境中能夠利用不同的底物，展現(xiàn)出極強的生存能力，甚至進化出比細菌更好的適應低溫環(huán)境的能力[1]。無論在南極、北極還是一些低緯度高海拔山地冰川的冰芯、凍土、融水和沉積物等各種冰凍圈環(huán)境中均有可培養(yǎng)酵母菌存在，而且發(fā)現(xiàn)棲息于低溫生態(tài)系統(tǒng)的酵母菌為一些特定的種屬[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，嗜冷酵母菌的代謝產(chǎn)物（如低溫酶、胞外多糖、多聚不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、γ-癸內(nèi)酯等）在食品、藥物開發(fā)以及現(xiàn)代生物降解工程中應用潛力巨大，使得嗜冷酵母菌資源逐漸引起人們的關(guān)注，正在成為一個新的研究熱點[1-4]。由于全球氣候逐漸變暖，冰川持續(xù)退縮，嗜冷微生物的生存環(huán)境不斷遭到破壞，開發(fā)和認識這些低溫微生物迫在眉睫。

果膠酶是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱，可分為兩大類：解聚酶和果膠酯酶。果膠酶主要應用于果汁提取、果汁澄清、果酒澄清與過濾、果實脫皮、紡織工業(yè)麻類（亞麻、苧麻）脫膠、畜牧業(yè)的飼料添加劑及中藥營養(yǎng)液的深加工等。冷適應果膠酶具有低溫條件下高活性的優(yōu)點，應用在果汁澄清等方面防止果汁營養(yǎng)成分破壞，此外，低溫條件下保護食品熱敏性物質(zhì)不被破壞、防止微生物污染。

天山烏魯木齊河源一號冰川是我國在冰川水文、氣候變化、生態(tài)退縮等基礎(chǔ)研究方面最為詳盡的冰川。本研究從天山一號冰川底部沉積層空水及融水中分離篩選耐低溫酵母菌菌株，通過分子生物學方法揭示菌株的物種多樣性、系統(tǒng)進化關(guān)系，了解其生態(tài)生理及產(chǎn)胞外酶特征，以期為后續(xù)研究開發(fā)低溫酵母菌的生物技術(shù)利用潛力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

用于PCR 擴增的全套試劑及擴增引物：寶生物工程大連（TaKaRa）有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒：加拿大Bio Basic Inc.公司；相關(guān)生理生化試驗所用試劑購自天津市巴斯夫化學試劑廠及天津市致遠化學試劑廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基采用孟加拉紅（rose Bengal，RB）培養(yǎng)基：瓊脂15 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，氯霉素0.1 g/L，氯硝胺（dichloran）溶液1 mL/L；孟加拉紅溶液0.5 mL/L，pH值調(diào)至5.6。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：麥芽浸膏30 g/L，蛋白胨0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH值調(diào)至5.6。

產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基：果膠10 g/L；酵母提取物10 g/L；蛋白胨20 g/L；葡萄糖20 g/L；瓊脂20 g/L，pH值調(diào)至7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

Fresco21高速冷凍離心機：美國Thermo公司；Tprofessional PCR儀：德國Biometra公司；Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng)、170-8720 icycler定量基因擴增儀：美國Bio Rad 公司；ABI377 DNA自動測序儀：上海生工生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

（1）低溫土樣采集

凍土樣品采自天山一號冰川北側(cè)的空冰斗地區(qū)多年凍土層，海拔3 833 m以上區(qū)域（43°07.125N，86°48.707E）（年平均地溫為-4.95 ℃），采集低溫土樣。沿33 m深的凍土剖面每隔20 cm取樣，然后將凍土樣品迅速裝入己滅菌的土壤盒內(nèi)，置于車載冰箱中保存。運回實驗室后，在超凈工作臺上削去表層可能受到污染的樣品，于-20 ℃保存?zhèn)溆茫脴藴蕄H計測定土壤浸出液pH值。

（2）冰川融水樣品

從烏魯木齊河源天山一號冰川站，海拔3 250 m以上區(qū)域（年平均地溫為-4.95 ℃）的高寒環(huán)境中采集冰川流動和沉積兩種融水，溫度分別為1.0 ℃和1.5 ℃，將水樣迅速裝入己滅菌的廣口瓶內(nèi)，置于車載冰箱中保存。運回實驗室后立即過濾并富集融水中微生物，過濾液于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨纤羞^程均在無菌條件下完成。

1.3.2 菌株的分離和保藏

菌株分離采用酵母菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基[6]和分離培養(yǎng)基[7]。菌株分離方法：在超凈工作臺上用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾水樣，收集濾膜上的菌體。采用梯度稀釋平板涂布法分離水樣品中的可培養(yǎng)酵母。15 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待菌落長出后，根據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)等表型差異進行初步分離，轉(zhuǎn)接劃線后，將所得純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到Y(jié)EPD斜面培養(yǎng)基中4 ℃?zhèn)溆?。已純化菌株保存于裝有20%滅菌甘油管的保藏管中，并存于-70 ℃冰箱保藏。

1.3.3 產(chǎn)果膠酶酵母菌的篩選[8]

在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離純化的低溫菌株，16 ℃培養(yǎng)3 d后在培養(yǎng)基表面分別滴加剛果紅溶液（1 mg/mL）染色10～15 min，再用NaCl（1 mol/L）溶液清洗，觀察菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生。

1.3.4 低溫酵母菌形態(tài)學和生理生化特性鑒定

（1）酵母菌形態(tài)特征

根據(jù)酵母菌分類學鑒定標準方法對供試菌株進行鑒定[9]。

（2）最適生長溫度的確定

將活化的酵母菌種以0.5 mL的接入量接入裝有5 mL的YEPD（pH 5.6）液體富集培養(yǎng)基中，分別在4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃及25 ℃的5個溫度梯度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，波長420 nm處測光密度值OD420nm。

1.3.5 PCR擴增及測序

（1）總DNA提取

用MAKIMURA K等[10]的方法提取菌株總DNA。

（2）PCR擴增26S rDNA D1/D2區(qū)基因[11-12]

采用酵母菌通用引物NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5'-TCC TCC GTC TAT TGA TAT GC-3′）對26S rDNA D1/D2區(qū)基因片段進行PCR擴增。擴增條件[13]：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應在icycler定量基因擴增儀上進行。1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認擴增效果和片段大小。

PCR 產(chǎn)物用EZ-10柱純化后，由ABI377 DNA自動測序儀直接測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)果膠酶酵母菌篩選及產(chǎn)酶菌株形態(tài)特征

培養(yǎng)基篩選結(jié)果表明：68株菌株中4株菌株能在以果膠為底物培養(yǎng)基中產(chǎn)生明顯的透明圈，結(jié)果如圖1所示。編號分別為C2、C9、L1、L13，初步判斷這幾株酵母菌產(chǎn)果膠酶。

圖1 菌株產(chǎn)酶透明圈Fig.1 Transparent circle of pectinase-producing strains

由圖1初步判斷這幾株低溫酵母菌能產(chǎn)果膠酶，其生長特性與形態(tài)特性見表1。

由表1可知，培養(yǎng)48 h后，麥芽浸膏培養(yǎng)基上形成顏色和形態(tài)有所不同的酵母菌。C2菌株：乳白色、中央隆起、邊緣規(guī)則、不易于挑起的直徑約2～3 mm的奶油狀菌落、表面光澤、培養(yǎng)時間3～5 d，菌落沒有明顯變大。C9菌株：白色、中央隆起、邊緣較規(guī)則、易于挑起的直徑約2～3 mm的奶油狀菌落、表面無光澤、培養(yǎng)時間延長至3～5 d，菌落直徑可達到4 mm。L1菌株：乳白色、中央隆起、邊緣規(guī)則、不易于挑起的直徑約1～2 mm的奶油狀菌落、表面光澤、培養(yǎng)時間3～5 d，菌落沒有明顯變大。L13菌株：淺橘黃色、中央隆起、邊緣規(guī)則、不易于挑起的直徑約4～5 mm的奶油狀菌落、表面光澤、培養(yǎng)時間3～5 d后，菌落變大但不是很明顯。

表1 低溫酵母菌株的生長特性與形態(tài)特性Table 1 Growth characteristics and morphological characteristics of psychrophilic yeast

2.2 26S rDNA基因序列同源性分析

將提取的基因組DNA以NLl和NL4通用引物特異擴增酵母菌的26S rDNA電泳結(jié)果見圖2。

圖2 PCR 擴增產(chǎn)物電泳檢測圖Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplification product

據(jù)Marker相對分子質(zhì)量大小顯示，四株菌的26S rDNA基因D1/D2區(qū)目片段大小約550～600 bp，由圖2可知，擴增產(chǎn)物均為單一條帶無非特異擴增現(xiàn)象，并且試驗菌株均符合Kuttzman&Robnett所定的同種內(nèi)不同菌株間差異不超過1%的標注。

2.3 產(chǎn)果膠酶酵母菌系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR產(chǎn)物純化后直接由上?；瞪锕こ逃邢薰居肁BI3700基因測序儀進行測序。將4株酵母菌株所獲得的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列提交美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），通過Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已發(fā)表的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列進行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3和表2。

由圖3、表2可知，C2菌株與（Cryptococcus maceransDQ377662）親緣關(guān)系最近，序列同源性均為99%，形成一個簇群，結(jié)合C2菌株的形態(tài)學特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，將該菌鑒定為隱球酵母屬；C9菌株與（Cryptococcussp.DQ377668）親緣關(guān)系最近，序列同源性均為99%，形成一個簇群，結(jié)合C9菌株的形態(tài)學特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，將該菌鑒定為隱球酵母屬；L1菌株與（Rhodotorula laryngisJQ768911）親緣關(guān)系最近，序列同源性均為99%，形成一個簇群，結(jié)合L1菌株的形態(tài)學特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，將該菌鑒定為紅酵母屬；L13菌株與（Rhodotorulasp.JX124722）親緣關(guān)系最近，序列同源性均為98%，形成一個簇群，結(jié)合L13菌株的形態(tài)學特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，將該菌鑒定為紅酵母屬。

圖3 基于26S rDNA序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast strain based on 26S rDNA regional sequence

表2 分離菌株依據(jù)26S D1/D2序列鑒定結(jié)果Table 2 Identification results based on 26S rDNA regional sequence

3 結(jié)論

本研究通過對天山烏魯木齊河源一號冰川融水可培養(yǎng)酵母菌的分離和篩選，了解冰川低溫酵母菌的生長特性、系統(tǒng)發(fā)育多樣性和冰川低溫微生物物種多樣性。實驗中所篩得的酵母菌株能夠代表低溫微生物的生理特性，其最適生長溫度較低，屬于耐冷菌范疇。分離的產(chǎn)酶菌株生長范圍較寬，也能夠在較高的溫度下正常生長，可能是常溫菌在低溫條件下長期進化的結(jié)果。盡管科學家們已經(jīng)從低溫微生物中分離純化了多種低溫酶，但國內(nèi)目前對于產(chǎn)低溫酶菌株及其所產(chǎn)低溫酶的酶學性質(zhì)開展的基礎(chǔ)性研究卻很少，而且僅僅依據(jù)可培養(yǎng)菌株的26S rRNA基因測序技術(shù)并不能反應產(chǎn)酶微生物的多樣性，只有通過產(chǎn)酶分析，才能真正了解產(chǎn)酶菌株的生物多樣性，篩選出優(yōu)質(zhì)高效的產(chǎn)酶菌種，為產(chǎn)低溫酶生物技術(shù)的應用奠定理論基礎(chǔ)。

本研究從冰川凍土樣品共分離得到68株低溫酵母，待測菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫中菌株的比對發(fā)現(xiàn)隸屬于7個屬（1個子囊菌屬和6個擔子菌屬），隱球酵母屬（Cryptococcus）是一種機會致病性真菌，在本次所篩選的菌株中占到總數(shù)的40%，產(chǎn)低溫酶的比例最大，這一結(jié)果與其他地區(qū)分離出低溫酵母菌的優(yōu)勢菌種相一致[14]；其次是紅酵母菌屬（Rhodotorula）和擲孢酵母屬（Sporobolomyces）。26S rDNA 5′末端有一個長約600 bp 的D1/D2序列，對核苷酸序列可變區(qū)D2的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域在同種間的該區(qū)域核苷酸的差異＜1%，而不同種之間的差異通常遠遠大于這個數(shù)據(jù)，雖然同一系統(tǒng)發(fā)育類群的菌株其26S rDNA序列相似性很高，還應該結(jié)合表型特征以及更精確的分子指紋技術(shù)來區(qū)分和篩選高效產(chǎn)酶菌株。KIM J K等[15]的研究指出，使用萃取法從冬孢酵母屬（Rhodosporidiumsp.）中提取β-胡蘿卜素，對提取色素及類胡蘿卜素等營養(yǎng)素將會有進一步的開發(fā)研究，未來可能會運用到實際生產(chǎn)中。

本研究對冰川中可培養(yǎng)酵母菌進行了分離篩選，了解了冰川中低溫酵母菌的生長特性、系統(tǒng)發(fā)育和物種多樣性，并對其能否產(chǎn)果膠酶進行了驗證，在后續(xù)實驗中會對低溫酵母菌的產(chǎn)酶活性進行實驗驗證與拓展，以及使用宏基因組學對冰川中低溫酵母菌的總DNA建立克隆文庫，以期更加準確的了解極端環(huán)境中酵母菌的系統(tǒng)進化地位。

[1]BUZZINI P,BRANDA E,GORETTI M,et al.Psychrophilic yeasts from world-wide habitats:diversity,adaptation strategies and biotechnological potential[J].FEMS Microbiol Ecol,2012,82(3):217-241.

[2]VISHNIAC H S.Yeast biodiversity in the antarctic[M]//PETER G,ROSA C.The yeast handbook.Biodiversity and ecophysiology of yeasts.Springer:Berlin,2006.

[3]SHIVAJI S,BHADRA B,RAO R S,et al.Rhodotorula himalayensissp.nov.,a novel psychrophilic yeast isolated from Roopkund Lake of the Himalayan mountain ranges,India[J].Extremophiles,2008,12(3):375-381.

[4]LEE J K,PARK K S,PARK S,et al.An extracellular ice-binding glycoprotein from an Arctic psychrophilic yeast[J].Cryobiology,2010,60(2):222-228.

[5]PATHAN A A K,BHADRA B,BEGUM Z,et al.Diversity of yeasts from puddles in the vicinity of Midre Love'nbreen Glacier,arctic and bioprospecting for enzymes and fatty acids[J].Curr Microbiol,2010,60(4):307-314.

[6]KURZMAN C P,ROBNETT C J.Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences[J].Anton Leeuw,1998,73(4):331-371.

[7]KURZMAN C P,ROBNETT C J.Identification and phylogeny of clinically Important ascomycetous yeasts based on nucleotide divergence in the 5'end of the large subunit(26S)ribosomal DNA gene[J].J Clin Microbiol,1997,35(5):1216-1223.

[8]張浩森，繆 靜，余曉斌.果膠酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J].生物學雜志，2008，25（2）：28-31.

[9]YARROW D,KURTZMAN C P,FELL J W.The yeasts,a taxonomic study(4th edn)[M].Amsterdam:Elsevier Science Publishers,1998.

[10]MAKIMURA K,MURAYAMA Y S,YAMAGUCHI H.Detection of a wide range of medically important fungal species by polymerase chain reaction(PCR)[J].J Med Microbiol,1994,40:358-364.

[11]張健紅，李 寅，陳 堅.一株堿性果膠酶高產(chǎn)細菌的分離、系統(tǒng)發(fā)育分析和產(chǎn)酶條件的初步優(yōu)化[J].應用與環(huán)境生物學報，2005，11（3）：354-358.

[12]廖 敏，陳希文，姜立春，等.假單胞菌B41 產(chǎn)果膠酶發(fā)酵條件的研究[J].中國釀造，2012，31（11）：58-62.

[13]LIBKIND D,BRIZZIO S,RUFFINI A,et al.Molecular characterization of carotenogenic yeasts from aquatic environments in Patagonia,Argentina[J].Anton Leeuw,2003,84(4):313-322.

[14]BRANDA E,TURCHETTI B,DIOLAIUTI G,et al.Yeast and yeast-like diversity in the southernmost Glacier of Europe(Calderone glacier,Apennines,Italy)[J].FEMS Microbiol Ecol,2010,72(3):354-369.

[15]KIM J K,KIM J I,LEE N K,et al.Extraction of β-Carotene produced from yeastRhodosporidiumsp.and its heat stability[J].Food Sci Biotechnol,2010,19(1):263-266.