孫玉英，張繼泉*

（1.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，淮海工學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

目前，對(duì)蝦疾病仍然是困擾對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的一大難題，由弧菌屬（Vibrio）細(xì)菌引起的弧菌病是其中危害最大的細(xì)菌性疾病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。由于弧菌是海洋環(huán)境中最常見(jiàn)的細(xì)菌類(lèi)群之一，廣范分布于河口海區(qū)以及海洋生物體中，同時(shí)弧菌是一類(lèi)條件致病菌，當(dāng)水體環(huán)境變化，弧菌尤其是致病性弧菌繁殖迅速，如數(shù)量超過(guò)閾值則容易引發(fā)對(duì)蝦弧菌病。對(duì)蝦病的防治主要是通過(guò)添加化學(xué)物質(zhì)、細(xì)菌組分、多糖、動(dòng)植物提取物、營(yíng)養(yǎng)因子以及細(xì)胞分裂素等免疫增強(qiáng)劑等增強(qiáng)對(duì)蝦的免疫力[6]。

殼聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖，殼聚糖作為抑菌劑具有毒性低、使用安全等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。目前殼聚糖作為抗菌劑得到了廣泛的應(yīng)用，但殼聚糖較低的溶解性使其應(yīng)用受到限制，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改性后的水溶性衍生物可使其應(yīng)用領(lǐng)域得到進(jìn)一步的拓展[9]。其中殼聚糖鹽酸鹽是將殼聚糖簡(jiǎn)單改性后的一種水溶性產(chǎn)物。由于殼聚糖鹽酸鹽保持了殼聚糖的品質(zhì)，具有良好的成膜性和抑菌性，被用于食品、果蔬等的添加劑和保鮮劑。但殼聚糖鹽酸鹽被用于水產(chǎn)病害防治尚少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)研究殼聚糖鹽酸鹽對(duì)幾種水產(chǎn)致病弧菌的抑菌效應(yīng)，從而探討殼聚糖鹽酸鹽用于防治對(duì)蝦弧菌病的可行性，旨在為對(duì)蝦弧菌病的防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鰻弧菌（Vibrio anguillarum）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）由淮海工學(xué)院海洋學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌體的保存和培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

固體LB培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2%瓊脂。

1.1.3 藥品

殼聚糖鹽酸鹽：浙江金殼藥業(yè)有限公司，脫乙酰度為80.0%～90.0%，黏度為10～120 MPa·s。

1.2 儀器與設(shè)備

BS323S電子天平：賽多制斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；spx-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)醫(yī)療器械有限公司；HYG全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HD920新型潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司：Infinite 200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將菌種采用平板劃線法接種在平板上培養(yǎng)1 d，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基稀釋為107～108CFU/mL。

1.3.2 抑菌圈的測(cè)定[10]

用打孔器在濾紙上打出直徑6 mm的濾紙片，置于培養(yǎng)皿中高壓蒸汽滅菌（121 ℃滅菌20 min）后，備用。實(shí)驗(yàn)組浸泡在殼聚糖鹽酸鹽溶液中，對(duì)照組浸泡在無(wú)菌水中。

按照無(wú)菌操作的要求向無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入適量LB培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿中約10 mL，即培養(yǎng)基的厚度均約為3.6 mm。培養(yǎng)基凝固后，用移液器吸取0.1 mL菌懸液于培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂布均勻，然后用鑷子取出100 mg/mL溶液中浸泡2 h的濾紙片，將濾紙片輕輕放入培養(yǎng)基表面，每個(gè)培養(yǎng)皿等距離放三個(gè)濾紙片，用無(wú)菌水做空白對(duì)照，置于培養(yǎng)皿正中央。放入培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間24 h）。取出后觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)出濾紙片抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果。

1.3.3 最小抑菌濃度測(cè)定

每種供試菌均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（6個(gè)孔只加菌液），陰性對(duì)照（6個(gè)孔只加無(wú)菌培養(yǎng)基）。副溶血弧菌的殼聚糖鹽酸鹽溶液質(zhì)量濃度為40 mg/mL，哈維氏弧菌和鰻弧菌的殼聚糖鹽酸鹽溶液質(zhì)量濃度為60 mg/mL。在實(shí)驗(yàn)組的每一個(gè)孔中各加入100 μL菌液，取相應(yīng)質(zhì)量濃度的供試藥液100 μL加入到實(shí)驗(yàn)組的第一個(gè)孔中，混勻后，吸取100 μL混合液加入到第二個(gè)實(shí)驗(yàn)孔，依次稀釋下去，直到第十二個(gè)孔混勻后吸取100 μL混合液棄去，每種供試菌的實(shí)驗(yàn)組均設(shè)三組平行實(shí)驗(yàn)共三行（每行12個(gè)孔）。用酶標(biāo)儀在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，測(cè)定結(jié)束后將96孔板包好放在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 h測(cè)一次。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制出對(duì)應(yīng)的曲線。6～16 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)的最小殼聚糖鹽酸鹽質(zhì)量濃度作為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖鹽酸鹽的抑菌效力

采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)殼聚糖鹽酸鹽的抑菌性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 殼聚糖鹽酸鹽對(duì)3種供試菌的抑菌圈Table 1 Antibacterial circle of chitosan hydrochloride on three tested strains

由表1可知，殼聚糖鹽酸鹽對(duì)所有供試菌都有抑制作用，但殼聚糖鹽酸鹽對(duì)供試菌的抑菌作用是有差異的。抑菌效力從大到小依次為副溶血弧菌＞哈維氏弧菌＞鰻弧菌。

2.2 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對(duì)供試菌的抑制作用

利用菌液作為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對(duì)供試菌的抑制作用分別見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽溶液對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.parahaemolyticu

圖1 結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度 為20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL和2.5 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液在前10 h內(nèi)對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，隨著溶液質(zhì)量濃度增大抑制作用也明顯變大，在10～16 h內(nèi)20 mg/mL和10 mg/mL質(zhì)量濃度的仍然具有明顯的抑制作用，而5 mg/mL和2.5 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液則抑制作用變?nèi)?。連續(xù)培養(yǎng)16 h后，質(zhì)量濃度1.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液對(duì)副溶血弧菌不再具有抑制作用，因此對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL。

圖2 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對(duì)哈維氏弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.harveyi

圖2結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為30 mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液在前16 h內(nèi)對(duì)哈維氏弧菌具有明顯的抑制作用，并且隨著質(zhì)量濃度的增大抑制作用也逐漸增大。連續(xù)培養(yǎng)16 h后，殼聚糖鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為1.625 mg/mL時(shí)，對(duì)哈維氏弧菌的抑制不再明顯，因此對(duì)哈維氏弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為3.25 mg/mL。弧菌的抑菌圈直徑最大，因此可以認(rèn)為殼聚糖鹽酸鹽對(duì)副溶血弧菌的抑菌效果最好。殼聚糖鹽酸鹽對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌濃度為2.5 mg/mL，而對(duì)哈維氏弧菌和鰻弧菌的最小抑菌濃度3.25 mg/mL。上述研究為殼聚糖鹽酸鹽運(yùn)用于對(duì)蝦弧菌病的防治提供理論依據(jù)。

殼聚糖在水質(zhì)凈化、抗菌、提高機(jī)體免疫力等方面都具有良好的效果，且其原料豐富，降解產(chǎn)物無(wú)毒無(wú)害，解決了使用抗生素帶來(lái)的殘留和抗藥性問(wèn)題。因此，其在無(wú)公害水產(chǎn)品的養(yǎng)殖生產(chǎn)中有著廣闊的應(yīng)用前景[14-16]，但殼聚糖較低的溶解性使其應(yīng)用受到限制。殼聚糖鹽酸鹽是殼聚糖簡(jiǎn)單改性后的一種水溶性產(chǎn)物，不但保留了殼聚糖在水質(zhì)凈化、抗菌和提高機(jī)體免疫力等方面的良好效果，而且殼聚糖鹽酸鹽對(duì)人體具有保健功能。所以探討殼聚糖鹽酸鹽用于對(duì)蝦弧菌病的防治具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

圖3 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對(duì)鰻弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.anguillarum

圖3結(jié)果顯示，在前6h，質(zhì)量濃度為30mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽對(duì)鰻弧菌具有明顯的抑制作用，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，質(zhì)量濃度降低，抑制作用慢慢減弱。連續(xù)培養(yǎng)6 h時(shí)，質(zhì)量濃度為1.625 mg/mL殼聚糖鹽酸鹽對(duì)鰻弧菌不再具有明顯的抑制作用，因此殼聚糖鹽酸鹽對(duì)鰻弧菌的最小抑菌濃度為3.25 mg/mL。

3 結(jié)論

目前，防治對(duì)蝦弧菌病害的方法主要是藥物防治[11-13]，藥物防治雖然具有操作簡(jiǎn)單，效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，但不可避免的會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生一定的耐藥性，還會(huì)對(duì)水域環(huán)境造成不同程度的破壞，而且藥物殘留也會(huì)對(duì)后續(xù)的食品安全造成很大影響。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)殼聚糖鹽酸鹽的體外抑菌性能進(jìn)行了研究，采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定了殼聚糖鹽酸鹽對(duì)副溶血弧菌、哈維氏弧菌和鰻弧菌的抑菌性能。殼聚糖鹽酸鹽對(duì)副溶血

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