劉勝男，王亞洲，石林霞，李市場，古紹彬

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

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γ-亞麻酸產生菌的低能離子束誘變選育

劉勝男，王亞洲，石林霞，李市場，古紹彬

(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023)

為了得到γ-亞麻酸(GLA)高產菌株，以深黃被孢霉As3.3410為出發(fā)菌株，利用氮離子(N+)注入誘變，并采用馬來酰肼抗性篩選和紅四氮唑(TTC)法相結合對突變株進行篩選。試驗結果表明：當能量為10 keV時，最佳氮離子誘變劑量為1.56×1015cm-2；當馬來酰肼的添加量為40 mg/L時，出發(fā)菌株的抑制率為100%；TTC法酶活測定的最佳條件為：溫度35 ℃、pH為8.4、TTC濃度為8 g/L、反應時間為1 h，以此作為搖瓶初篩的條件。經過反復誘變篩選獲得一株遺傳穩(wěn)定的高產突變株F312，其γ-亞麻酸產量為1 236 mg/L，比出發(fā)菌株(480 mg/L)提高了157.5%。

深黃被孢霉；γ-亞麻酸；低能離子束；馬來酰肼；紅四氮唑

0 引言

部分絲狀真菌微生物含有大量的油脂，具有巨大的商業(yè)生產潛力[1]，微生物油脂近年來已成為研究熱點。γ-亞麻酸(GLA)因具有重要的生理學功能而倍受人們的關注，它是合成前列腺素的前體物質，對一些疾病有積極的預防和治療作用，如高血壓、風濕性關節(jié)炎[2]、多發(fā)性硬化癥[3]、精神分裂癥[4]、異位性濕疹[5]、經前綜合癥[6]等。文獻[7-8]指出γ-亞麻酸可以作為選擇性抗癌劑。γ-亞麻酸是人體必需的脂肪酸，像維生素一樣不能在人體內合成，必需從食物中攝取。而市售富含γ-亞麻酸的藥品、保健品及食品大部分是從植物中提取，如E膠丸、保心乳等。由于月見草等富含γ-亞麻酸的植物易受氣候環(huán)境條件的影響，產量不穩(wěn)定，精煉成本高，無法滿足市場需求，人們開始探索微生物發(fā)酵法生產γ-亞麻酸。在富含γ-亞麻酸的產油微生物育種里主要采用物理或化學誘變的方法改變遺傳物質，再測定突變株發(fā)酵參數(shù)挑選并保存正突變菌株[9-10]。這種篩選方法工作量大，效率低。由γ-亞麻酸在微生物體內的合成途徑可知：γ-亞麻酸是由脂肪酸脫氫酶系催化油酸、亞油酸等脂肪酸脫氫去飽和而產生的[11]；脂肪酸脫氫酶是深黃被孢霉合成GLA的關鍵酶，而脫氫酶的活性受到馬來酰肼等物質的抑制[12]。紅四氮唑(TTC)是一種氧化劑，從脫氫酶接受電子后，自身由無色被還原成紅色的三苯基甲臜(TF)，從而可以表示細胞內的脫氫酶活性。通過TTC法測定脂肪酸脫氫酶酶活可間接表示深黃被孢霉生產GLA的能力。本文以深黃被孢霉As3.3410為出發(fā)菌株，利用低能離子修飾技術對菌株進行誘變，并采用馬來酰肼與TTC法篩選GLA高產突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

深黃被孢霉As3.3410(購于廣東微生物保藏中心)。

保藏活化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L，蛋白胨4 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41.5 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO42 g/L，pH6.0。115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100.90 g/L，KNO31.57 g/L，乙酸鈉3.42 g/L，檸檬酸鈉4.56 g/L，酵母膏3.75 g/L，KH2PO42.25 g/L，MgSO47H2O 0.6 g/L，CaCl20.30 g/L，F(xiàn)eSO40.15 g/L，ZnSO40.20 g/L。115 ℃滅菌30 min。

活化培養(yǎng)：轉接斜面后置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏。

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面孢子，接種于種子培養(yǎng)基中(250 mL的三角瓶裝液量為50 mL)，28 ℃、190 r/min搖床培養(yǎng)1 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：吸取5 mL種子液接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL的三角瓶裝液量為50 mL)，28 ℃、190 r/min搖床培養(yǎng)7 d。

1.2 菌種誘變與篩選

1.2.1 離子束誘變

用5 mL無菌生理鹽水洗脫斜面孢子，制成孢子懸液，然后梯度稀釋至10-5(孢子懸液濃度大約為106mL-1)。取0.1 mL稀釋孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，無菌風干后進行氮離子注入。在注入機(中國科學院離子束生物工程重點實驗室研究制備的LZD 900 多功能離子注入機)上，選用10 keV、15 keV兩個能量級別的氮離子(N+)，以不同劑量的氮離子(N+)對風干過的孢子平板進行注入。將真空未接受離子注入的處理作為真空對照[13]。

氮離子注入后立即在超凈工作臺上用新鮮無菌生理鹽水洗脫，進行適當?shù)南♂?，并涂布于PDA培養(yǎng)基平板上。每個誘變梯度做3個平行，28 ℃培養(yǎng)3 d，平板上長出單菌落后，進行菌落計數(shù)，計算存活率。

存活率=(誘變處理后菌落總數(shù)/對照中的菌落總數(shù))×100%。

1.2.2 馬來酰肼抗性篩選

取0.2 mL誘變后稀釋到適當濃度的孢子懸液，均勻涂布于含有40 mg/L馬來酰肼的PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d；待長出菌落后，挑取菌落大、生長快的菌落接種到PDA斜面保藏培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏備用。

1.2.3 脂肪酸脫氫酶活性測定—TTC法篩選

新鮮菌體過濾收集后用蒸餾水洗滌兩遍，取1 g菌體置于具塞試管中，加入2 mL質量濃度為8 g/L TTC溶液，Tris-HCl(pH8.4) 2 mL，35 ℃于暗處放置1 h。菌體用蒸餾水洗滌兩遍后研磨成勻漿，用6 mL氯仿室溫提取TF，取氯仿層，用分光光度計在485 nm波長下測定染色程度[14]。

1.3 生物量測定與油脂的提取

生物量測定：將一定體積(V)發(fā)酵液過濾后用蒸餾水洗滌兩遍，得到濕菌體;然后置于電熱鼓風干燥箱內，于70 ℃下烘干至恒質量，測得干菌體的質量(W)。

生物量(g/L)：W0=W/V。

油脂的提取：將干菌體碾碎后稱取1 g，加入4 mol/L的鹽酸10 mL，振蕩混勻；室溫放置30 min后，沸水浴5 min；-20 ℃速冷20 min左右，加入氯仿-甲醇(v/v=1∶1)混合液20 mL，充分振蕩后，4 000 r/min離心20 min；棄上清，加入質量濃度為1 g/L NaCl溶液20 mL，混勻，4 000 r/min離心；棄上清，氯仿?lián)]發(fā)后得到油脂，稱量所得油脂的質量(W1)[15-16]。

產油量(g/L)：W2=W1×W0。

含油量：C=(W2/W0)×100%。

1.4 油脂脂肪酸成分分析

1.4.1 油樣預處理

取0.2 g油脂樣品置于具塞試管中，加入石油醚-乙醚(v/v= 4∶3)混合溶劑5 mL，振蕩溶解;再加入物質的量濃度為0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液4 mL，振蕩1 min;放置10 min后加入1 mL蒸餾水，靜置30 min待其分層，取上清液進樣[17]。

1.4.2 氣象色譜條件

選用美國安捷倫7890A氣象色譜儀，Agilent HP-519091J-413(30 mm×0.32 mm×0.25 μm)氣相色譜柱；氫火焰離子化(FID)檢測器。載氣為高純氮氣，氣體模式為恒流模式，流量為1 mL/min，尾吹氣(氮氣)流量為30 mL/min；H2流量為30 mL/min，空氣流量為400 mL/min。進樣量為0.5 μL，分流比(v/v)為50∶1。進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為260 ℃。柱溫采用三級程序升溫：初溫100 ℃，保持2 min；然后以17 ℃/min升溫至200 ℃，保持4.7 min；再以40 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min。

2 結果與分析

2.1 低能離子修飾技術對菌株的影響

低能離子束誘變有著特殊的作用過程和效應，其先后經歷物理、化學和生物學3個階段，最終引發(fā)終點生物學效應[18]。低能離子注入技術具有突變率高和突變譜寬的特點，不同能量和不同劑量的離子束作用于微生物細胞有著不同的效應，深黃被孢霉的存活率與氮離子的能量和劑量的關系如表1所示。

表1 存活率與氮離子能量和劑量之間的關系

突變率的高低與誘變的存活率密切相關，一般當菌種誘變的存活率為20%～30%時，突變率最高。表1中，當?shù)x子的能量為15 keV時，存活率均在20%以下；當?shù)x子的能量為10 keV時，存活率在10%～30%;而當?shù)x子誘變劑量為1.56×1015cm-2時,深黃被孢霉的存活率為26.3%。所以試驗選用10 keV，離子劑量為1.56×1015cm-2的氮離子作為誘變處理的誘變劑。

2.2 油脂高產菌株的篩選

微生物誘變選育是一種繁瑣而復雜的過程，往往耗費大量的精力也篩選不到理想的菌株。為了提高篩選效率，本文對誘變后菌株首先在平板上進行馬來酰肼篩選，除去大量的負突變及未突變菌株。脂肪酸脫氫酶是合成GLA的關鍵酶，在發(fā)酵后采用TTC法測定菌種的脂肪酸脫氫酶的活性，進一步去除脂肪酸脫氫酶活性不強、GLA生產能力弱的菌種，留下GLA生產能力強的菌種。

2.2.1 馬來酰肼抗性篩選

GLA是由一系列脂肪酸脫氫酶催化油酸、亞油酸等脂肪酸脫飽和而生成的，而脂肪酸脫氫酶的活性會受到馬來酰肼的抑制，使其不能合成正常生理活動所必需的GLA[19]。不同濃度的馬來酰肼對出發(fā)菌株生長的抑制效果不同。表2為馬來酰肼添加量與出發(fā)菌株深黃被孢霉As3.3410存活率及菌落直徑的關系。從表2可以看出：當馬來酰肼添加量小于40 mg/L時，深黃被孢霉的菌落存活率無顯著變化，菌落直徑隨添加量的增加而減小；當添加量大于40 mg/L時，幾乎不形成菌落，抑制率幾乎達到100%。因此，選擇40 mg/L的馬來酰肼作為篩選劑加入平板培養(yǎng)基中，初步淘汰脂肪酸脫氫酶酶活低或GLA產量低、不足以維持菌株正常生長的突變株，使平板上只有正突變的菌株得以生長，縮小后期篩選的范圍，提高篩選效率。

表2 馬來酰肼添加量與出發(fā)菌株深黃被孢霉As3.3410存活率及菌落直徑的關系

2.2.2 TTC法測定脂肪酸脫氫酶活性

紅四氮唑(TTC)法廣泛用于植物細胞及細菌的活力測定。脂肪酸脫氫酶是深黃被孢霉中合成GLA的關鍵酶，其活力的大小可間接表示細胞合成GLA能力的強弱。將TTC法用于深黃被孢霉菌絲體染色，以染色程度表示細胞內脂肪酸脫氫酶的活性[20]。通過對TTC法染色條件pH、溫度及TTC濃度的優(yōu)化，來確定最佳染色條件，結果如圖1所示，其中，OD485為樣品在485 nm時的吸光度值。從圖1a中可以看出：隨著TTC濃度的增加，菌絲體的染色程度逐漸加深；在TTC濃度為8 g/L時菌絲體染色程度最深，隨后又有所下降。從圖1b中可以看出：Tris-HCL緩沖溶液pH在8.4之前，隨著pH的升高，菌絲體染色萃取液的吸光度在增加；當Tris-HCL緩沖溶液的pH為8.4時，菌絲體染色程度最深；當pH大于8.4時，吸光度又呈現(xiàn)下降趨勢。由此可知,脂肪酸脫氫酶的酶活測定的最適pH值為8.4。從圖1c中可以看出：反應溫度低于35 ℃時，隨著反應溫度的升高，吸光度值逐漸變大；當反應溫度高于35 ℃時，吸光度值又呈現(xiàn)下降的趨勢。以此得出脂肪酸脫氫酶的最適反應溫度為35 ℃。確定脂肪酸脫氫酶酶活測定的最佳條件為：TTC溶液的濃度為8 g/L，最適pH為8.4，最適溫度為35 ℃，反應時間為1 h。

圖1 TTC濃度、pH、溫度對脂肪酸脫氫酶活性的影響

2.3 誘變篩選結果

經過反復的誘變→馬來酰肼平板抗性篩選→發(fā)酵第4天的脂肪酸脫氫酶酶活測定篩選，獲得5株高產菌株，其GLA產量及脂肪酸脫氫酶酶活(OD485)如表3所示。表3中，脂肪酸脫氫酶酶活從小到大依次為：As3.3410

表3 突變株與出發(fā)菌株比較表

注:菌種As3.3410為原始出發(fā)菌株，F(xiàn)208、F217、F369、F338、F312為經過反復誘變所獲得的高產菌株。

圖2 發(fā)酵過程As3.3410與F312主要參數(shù)比較

2.4 發(fā)酵特性

本文對高產菌株的發(fā)酵特性進行了初步研究(見圖2)。從圖2可以看出：F312及出發(fā)菌株As3.3410發(fā)酵過程中第3天到第8天的脂肪酸脫氫酶酶活的變化及GLA產量的變化。從第3天到第7天脂肪酸脫氫酶酶活隨著時間的增加呈現(xiàn)上升的趨勢；而到第8天有所下降，但整個發(fā)酵周期中突變株F312的脂肪酸脫氫酶酶活始終比出發(fā)菌株As3.3410的高。GLA產量隨發(fā)酵時間的增加而增長，在脂肪酸脫氫酶酶活較高時，GLA的生產速率加快，在第7天時趨于穩(wěn)定。通過用氣相色譜對出發(fā)菌株及高產菌株成分進行分析(見圖3)，可知突變株F312的GLA產量較出發(fā)菌株深黃被孢霉As3.3410的GLA產量有大幅度提高。

圖3 GLA氣相色譜圖

3 結論

通過離子束誘變及抗性篩選的研究，找出了獲得高產GLA深黃被孢霉的誘變篩選體系，該誘變篩選體系快速高效，可以對誘變后的突變株進行定向篩選，最終獲得了一株高產突變株F312。試驗結果如下：(1)采用10 keV的氮離子(N+)進行誘變，最佳離子束誘變劑量為1.56×1015cm-2。(2) 馬來酰肼的最佳篩選質量濃度為40 mg/L；TTC法酶活測定的條件為：溫度35 ℃、pH8.4、TTC質量濃度8 g/L、反應時間1 h。(3) 通過反復的誘變篩選，最終篩選出一株遺傳性穩(wěn)定的高產突變株F312，GLA產量達到1 236 mg/L，比出發(fā)菌株(480 mg/L)提高了157.5%。突變株F312發(fā)酵過程中脂肪酸脫氫酶活性和GLA產量均比出發(fā)菌株高，具有一定的商業(yè)研究價值，實驗室將進一步進行小罐發(fā)酵，挖掘其商業(yè)生產價值。

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國家自然科學基金項目(U1304307);河南科技大學大學生研究訓練計劃基金項目(2014121)

劉勝男(1991-),女,河南周口人,碩士生;李市場(1978-),男,河南洛陽人,副教授,博士,碩士生導師,主要研究方向為微生物育種.

2014-11-12

1672-6871(2015)03-0076-05

Q93

A