沈明志，李冬云，范 利，付振虹，韓寶石，李 可，胡 鑫，劉海斌，薛 橋*

?

銀杏葉提取物通過(guò)Wnt減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

沈明志1,2，李冬云1，范 利2，付振虹1，韓寶石1，李 可1，胡 鑫1，劉海斌3，薛 橋1*

（1解放軍總醫(yī)院海南分院心內(nèi)科，三亞 572013；2解放軍總醫(yī)院老年心內(nèi)科，北京 100853；392474部隊(duì)醫(yī)院內(nèi)科，三亞 572018）

探討銀杏葉提取物（EGB）對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響以及Wnt通路在其中的作用。取1d齡乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)后，應(yīng)用衣霉素（Tm）構(gòu)建心肌細(xì)胞損傷模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、Tm組、Tm＋EGB組、EGB組。噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率，雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)Wnt活性，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)C-myc、CyclinD1基因水平。Tm降低了心肌細(xì)胞存活率，EGB處理改善了心肌細(xì)胞存活率；與對(duì)照組比較，Tm組Wnt活性顯著降低，與Tm組比較，Tm＋EGB組Wnt活性、C-myc、CyclinD1水平明顯升高，而應(yīng)用Wnt抑制劑分泌型卷曲相關(guān)蛋白（sFRP），Wnt活性顯著下調(diào)，C-myc、CyclinD1水平下調(diào)，EGB的保護(hù)作用顯著下降。EGB可以抑制Tm誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與改善Wnt信號(hào)有關(guān)。

銀杏葉提取物；衣霉素；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；心肌細(xì)胞；Wnt

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與了膜蛋白與分泌蛋白的折疊過(guò)程，在細(xì)胞維持功能與存活過(guò)程中扮演了重要角色[1,2]。糖剝奪、病毒感染、錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白的增加將會(huì)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[3,4]。ERS是機(jī)體對(duì)外界或自身反應(yīng)的一種自我保護(hù)機(jī)制，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生存，但過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的ERS可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5,6]。

研究表明，Wnt信號(hào)通路在抗凋亡過(guò)程中扮演了重要角色[7?9]。然而，Wnt信號(hào)在ERS過(guò)程中扮演的作用迄今尚無(wú)報(bào)道。

銀杏葉又名白果葉，是從銀杏科植物銀杏的干燥葉提取的有效成分，主要化學(xué)成分包括銀杏內(nèi)酯及黃酮苷，具有保護(hù)心血管、改善微循環(huán)的功效[10,11]，但機(jī)制尚不完全清楚。

本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用衣霉素（tunicamycin，Tm）誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷模型[12]，觀察銀杏葉提取物（extracts ofleaf，EGB）對(duì)衣霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響，以及對(duì)Wnt信號(hào)通路表達(dá)水平的影響及意義，為EGB防治ERS相關(guān)性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

1日齡SD乳鼠（解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；EGB（中國(guó)藥科大學(xué)植化教研室）；杜爾貝科改良培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM，Gibco公司）；胎牛血清（四季青公司）；膠原酶、噻唑藍(lán)（MTT）雙熒光報(bào)告系統(tǒng)（Promega公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、5?溴?2?脫氧核苷尿嘧啶（BrdU）（Sigma公司）；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)試劑盒（TaKaRa公司）。

1.2 原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞

方法同文獻(xiàn)[13]，取1d齡乳鼠心臟，冰磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，剔除心房以及大血管等成分，將其剪成小米粒大小組織塊，用Ⅰ型膠原酶（1mg/ml）分次消化（3～5min/次）。收集心肌細(xì)胞懸液，加入含10%血清DMEM培養(yǎng)基中以終止消化，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清。重懸細(xì)胞，用滴管吹打至單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后接種于培養(yǎng)瓶，并在孵箱中差速貼壁1h。加入BrdU母液，使其終濃度為100μmol/L。37℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24h后，更換含BrdU的DMEM培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)孵育培養(yǎng)48h，備用。

1.3 藥物處理和實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組、Tm組、Tm+EGB組和EGB組。對(duì)照組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)液，不給予任何藥物；Tm組：培養(yǎng)液中加100ng/ml Tm；Tm+EGB組：培養(yǎng)液中加100ng/ml Tm和20、50、100μg/ml EGB；EGB組：培養(yǎng)液中加50μg/ml EGB。

1.4 MTT比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率

心肌細(xì)胞接種于96孔板，經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基處理后，隨機(jī)分組。經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理，每孔加入5mg/ml MTT母液10μl，37℃孵育4 h。吸棄上清，加入150μl DMSO以溶解沉淀，選擇490nm波長(zhǎng)，振蕩3min。檢測(cè)各孔吸光度（）值（值與活細(xì)胞數(shù)呈正比），實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR

提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Quanti Tect Reverse Transcription Kit試劑盒進(jìn)行細(xì)胞cDNA合成。使用ABI prism 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，應(yīng)用the Power SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR熒光檢測(cè)。β-actin作為內(nèi)參照。c-myc正義鏈：5'-CCTCAGTGGTCTTCCC-CTAC-3'，反義鏈：5'-CTGGAGCATTTGCGGTTG-3'；cyclinD1正義鏈：5'-GAGGAGCAGAAGTGCGAAGA-3'，反義鏈：5'- GGAGGGTGGGTTGGAAAT-3'；β-actin正義鏈：5'-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反義鏈：5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3'。

1.6 H9C2心肌細(xì)胞系培養(yǎng)及Topflash活性檢測(cè)

H9C2心肌細(xì)胞系（ATCC公司），應(yīng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2孵箱中37℃情況下進(jìn)行培養(yǎng)。取第三代以后細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

檢測(cè)Topflash活性方法同前[14]，應(yīng)用Lipo2000將Topflash和pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染36h后，應(yīng)用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光系統(tǒng)報(bào)告試劑盒分析Topflash活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響

將對(duì)照組心肌細(xì)胞存活率定義為100%。與對(duì)照組比較，Tm組心肌細(xì)胞存活率顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與Tm組相比，Tm（100ng/ml）+EGB（20μg/ml）組心肌細(xì)胞存活率輕度升高，而Tm+EGB（50或100μg/ml）心肌細(xì)胞存活率顯著升高，呈濃度依賴性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖1）。本部分實(shí)驗(yàn)表明，EGB能夠減輕Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

圖1 EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率的影響

Figure 1 Effects of EGB on Tm-induced cardiomyocytes viability

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

2.2 EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)Wnt信號(hào)通路的影響

為了研究Wnt信號(hào)通路在EGB改善心肌細(xì)胞存活率中的作用，我們應(yīng)用Topflash雙熒光報(bào)告系統(tǒng)轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞系，檢測(cè)Wnt活性。結(jié)果表明，Tm可以顯著降低Topflash活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；而加用EGB可以顯著改善Topflash活性，與Tm組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。與對(duì)照組相比，單用EGB時(shí)Topflash活性沒(méi)有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖2）。本部分研究結(jié)果表明，Tm能夠抑制Wnt活性，而加用EGB可以顯著改善Wnt活性。

圖2 EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Wnt活性的影響

Figure 2 Effects of EGB on Tm-induced Wnt activity in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

2.3 EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)C-myc、CyclinD1的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt信號(hào)通路在EGB改善心肌細(xì)胞存活率中的作用，我們檢測(cè)了Wnt信號(hào)通路下游基因C-myc、CyclinD1的水平。研究結(jié)果表明，Tm可以顯著下調(diào)C-myc、CyclinD1水平，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；而加用EGB兩者表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且呈現(xiàn)EGB濃度依賴性上調(diào)，與Tm組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。然而，與對(duì)照組相比，單用EGB時(shí)兩者表達(dá)水平并沒(méi)有顯著變化（＞0.05，圖3和圖4）。本部分研究結(jié)果進(jìn)一步表明，Tm抑制了Wnt活性，而EGB能夠顯著改善Wnt活性。

圖3 EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞C-myc水平的影響

Figure 3 Effects of EGB on Tm-induced C-myc in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

圖4 EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CyclinD1水平的影響

Figure 4 Effects of EGB on Tm-induced CyclinD1 in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin. Compared with control group,*<0.05; compared with Tm group,#<0.05

2.4 抑制Wnt信號(hào)通路抵消EGB的保護(hù)作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt信號(hào)通路在EGB發(fā)揮保護(hù)作用中的地位，我們給予Wnt抑制劑分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled related protein，sFRP，圖5）。結(jié)果表明，與Tm＋EGB組相比，Tm＋EGB＋sFRP組心肌細(xì)胞存活率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。本部分研究結(jié)果表明，EGB主要是通過(guò)Wnt信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用的。

3 討 論

心血管疾病的發(fā)病率和死亡率居高不下，是威脅人類健康的“第一殺手”。在發(fā)達(dá)國(guó)家，心血管疾病的病死率呈現(xiàn)了下降趨勢(shì)，而在我國(guó)，心血管疾病的病死率還在迅猛增長(zhǎng)，防控形勢(shì)不容樂(lè)觀。心血管疾病發(fā)病過(guò)程伴隨心肌細(xì)胞凋亡，由于心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，因而導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量絕對(duì)減少，使心肌收縮力下降，從而發(fā)展至心功能不全，導(dǎo)致心力衰竭[14]。研究表明，死亡受體和線粒體途徑是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡最主要的途徑；近十年來(lái)，ERS途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡越來(lái)越受到關(guān)注[15]，Tm可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白質(zhì)糖基化從而誘導(dǎo)ERS[16]。

圖5 Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)EGB保護(hù)作用的影響

Figure 5 Effects of Wnt signal pathway inhibitor on EGB protective role in cardiomyocytes

EGB: extracts ofleaf; Tm: tunicamycin; sFRP: secreted frizzled related protein. Compared withTm+EGB group,*<0.05

EGB是銀杏葉經(jīng)過(guò)多步驟分離提取后得到的天然活性物質(zhì)，主要為黃酮類、萜類內(nèi)酯化合物、多糖類等。大量研究表明，EGB具有拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎及抗過(guò)敏等作用。然而，EGB對(duì)Tm誘導(dǎo)的心肌損傷是否有保護(hù)作用目前尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Tm構(gòu)建ERS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型，觀察EGB對(duì)細(xì)胞存活狀況的影響。

本研究表明，應(yīng)用Tm處理乳鼠心肌細(xì)胞可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。而加用EGB的心肌細(xì)胞存活率明顯升高，并且呈現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)的濃度依賴性，首次發(fā)現(xiàn)了EGB可以減輕Tm誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證EGB的保護(hù)機(jī)制，我們將目光轉(zhuǎn)移到具有抗凋亡作用的Wnt信號(hào)通路上來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，Tm可以顯著降低Wnt活性，而加用EGB可以顯著恢復(fù)Wnt活性。為了進(jìn)一步證明兩者的相關(guān)性，我們檢測(cè)了其下游基因C-myc、CyclinD1水平。研究發(fā)現(xiàn)，Tm可以降低兩者的水平，而加用EGB可以顯著恢復(fù)它們的水平，進(jìn)一步表明EGB可以顯著影響Wnt信號(hào)通路。為了證明EGB的保護(hù)作用是通過(guò)Wnt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，我們應(yīng)用了Wnt信號(hào)通路抑制劑sFRP，結(jié)果表明，加用sFRP抵消了EGB的保護(hù)作用，進(jìn)一步證實(shí)了EGB通過(guò)Wnt減輕了心肌ERS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，達(dá)到保護(hù)受損心肌細(xì)胞的目的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Tm激活了心肌細(xì)胞ERS，降低了Wnt活性，導(dǎo)致了心肌細(xì)胞損傷；而加用EGB，可以恢復(fù)Wnt活性，從而達(dá)到保護(hù)受損心肌細(xì)胞的目的。這可能為EGB抑制ERS誘導(dǎo)的心肌損傷提供新的治療靶點(diǎn)。

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（編輯: 李菁竹）

EGB attenuates endoplasmic reticulum stress-induced injury in cultured rat neonatal cardiomyocytes through Wnt signal pathway

SHEN Ming-Zhi1,2, LI Dong-Yun1, FAN Li2, FU Zhen-Hong1, HAN Bao-Shi1, LI Ke1, HU Xin1, LIU Hai-Bin3, XUE Qiao1*

(1Department of Cardiology, Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya 572013, China;2Department of Geriatric Cardiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;3Department of Internal Medicine, Hospital of Troop 92474, Sanya 572018, China)

To determine the effect of the extracts ofleaf (EGB) on the endoplasmic reticulum stress-induced cardiomyocyte injury and investigate the role of Wnt signal pathway in this process.Tunicamycin(Tm) was used to establish the endoplasmic reticulum stress model in rat cardiomyocytes which were isolated from neonatal rats in 1d after born and then cultured for 48h. There were 4 groups of cardiomyocytes, that is, control, Tm treated, Tm+EGB treated and EGB treated. MTT assay was used to detect cell viability. The dual-luciferase report system was used to measure Wnt activity. C-myc and CyclinD1 were detected by real-time PCR.Compared to control cells, Tm treatment resulted in significantly decreased cell viability, but the presence of EGB markedly attenuated the cell injury. The treatment also decreased the activity of Wnt, whereas co-treatment of Tm and EGB led to not only the increase in Wnt activity, but also recovery of the C-myc and CyclinD1 levels. However, Wnt inhibitor, secreted frizzled-related protein (sFRP) decreased Wnt activity, C-myc and CyclinD1 levels, and inversed EGB-induced protective effect.These findings demonstrate that EGB protects cardiomyocytes against Tm-induced injury through improving Wnt activity.

extracts ofleaf; tunicamycin; endoplasmic reticulum stress; cardio myocytes; Wnt

R284.14; R978.12; R329.24

A

10.11915/j.issn.1671-5403.2015.03.050

(CWS12J122).

2014?12?24;

2015?01?09

全軍后勤科研計(jì)劃（CWS12J122）

薛 橋, E-mail: xueqiao301@sina.com