楊 揚(yáng)，程小剛，仇 珺，肖 敏，田 宇，余 擎

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032）

Er：YAG激光聯(lián)合根管沖洗劑對根尖外多細(xì)菌生物膜的殺菌作用研究

楊 揚(yáng)，程小剛，仇 珺，肖 敏，田 宇，余 擎

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032）

目的：觀察Er：YAG激光與根管沖洗劑聯(lián)合應(yīng)用對根尖外多細(xì)菌生物膜的殺菌作用。方法：體外牛牙骨質(zhì)片上構(gòu)建根尖外多細(xì)菌（衣氏放線菌、血鏈球菌和糞腸球菌）生物膜并隨機(jī)分為6組。分別按以下方法進(jìn)行處理，A組：52．5 g／L次氯酸鈉（NaClO）液＋Er：YAG激光；B組：5 g／L NaClO液＋Er：YAG激光；C組：20 g／L洗必泰（CHX）液＋Er：YAG激光；D組：酸性水（SAEW）＋Er：YAG激光；E組：生理鹽水（陰性對照組）；F組：52．5 g／L NaClO液（陽性對照組）。每組又分為3個亞組，分別處理30 s、1 min、3 min（n＝6）。SEM觀察處理后多細(xì)菌生物膜形態(tài)，實(shí)時熒光定量PCR檢測各組間細(xì)菌數(shù)量變化。結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌數(shù)量在各時間點(diǎn)均顯著低于陰性對照組（P＜0．05）。其中A組殺菌效果最強(qiáng)，在30 s和3 min時與F組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），1 min時殺菌效果優(yōu)于F組（P＜0．05）。B、D組在1、3 min時與F組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05），30 s殺菌效果較F組略差（P＜0．05）。C組的殺菌效果在各時間點(diǎn)均弱于F組（P＜0．05）。結(jié)論：Er：YAG激光與幾種根管沖洗劑聯(lián)合應(yīng)用能殺滅根尖外微生物。

Er：YAG激光；多細(xì)菌微生物膜；根管沖洗劑；次氯酸鈉；洗必泰；強(qiáng)酸性水

根管治療是治療根尖周炎的主要方法，然而仍有些牙齒即使經(jīng)過完善的根管治療仍然會反復(fù)發(fā)作，即所謂的頑固性根尖周炎。有研究認(rèn)為造成頑固性根尖周炎的主要原因在于根尖外牙骨質(zhì)表面形成了生物膜［1］，臨床上通常行根尖區(qū)手術(shù)去除這種根尖外生物膜。傳統(tǒng)根尖手術(shù)的成功率能達(dá)到60%左右，隨著手術(shù)方法的改進(jìn)和牙科顯微鏡等設(shè)備的應(yīng)用更將手術(shù)治愈率提高到90%［2］。但是這種手術(shù)切除根尖的方法必然會造成牙根縮短，對于有牙周病、牙齒固位力差及身體耐受力差的患者并不適合。

Er：YAG激光自應(yīng)用于牙體組織開始［3］，就因其熱損傷小、能精確切割、減少出血、有抗菌能力等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。研究發(fā)現(xiàn)，Er：YAG激光對于根管內(nèi)包括糞腸球菌在內(nèi)的細(xì)菌都具有很好的殺滅作用［4－6］。尤其是當(dāng)其與根管沖洗液聯(lián)合應(yīng)用時，激光激發(fā)沖洗液產(chǎn)生空氣泡沫和脈沖壓力波，進(jìn)一步發(fā)揮激光和沖洗液的殺菌效果，能有效去除根尖和牙本質(zhì)小管內(nèi)的細(xì)菌［7－10］。同時Er：YAG還能減少細(xì)菌毒素在牙骨質(zhì)中的擴(kuò)散，抑制微生物膜的再生［11］。然而國內(nèi)外對于Er：YAG激光聯(lián)合根管沖洗劑在根尖外的應(yīng)用研究還很少。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在體外建立多細(xì)菌微生物膜，以Er：YAG激光聯(lián)合多種根管沖洗液進(jìn)行處理，觀察細(xì)菌形態(tài)和數(shù)量的改變，為Er：YAG激光應(yīng)用于根尖外生物膜發(fā)揮殺菌作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 主要材料、試劑和儀器

糞腸球菌（ATCC 29212，美國）；衣氏放線菌（ATCC 12103，美國）；血鏈球菌（ATCC 10556，美國）；BHI培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；次氯酸鈉（天津天力化學(xué)試劑有限公司）；生理鹽水（Kishida Chemical Co，日本）；強(qiáng)酸電解質(zhì)水（Super OxseedLabo；Amano Co，日本）；洗必泰葡萄糖酸鹽粉劑（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科）；24孔板（Corning，美國）；厭氧工作站（Don whitley H85，英國）；慢速切鋸（BUEHLER，美國）；Er：YAG激光儀（Fontona Lasers，斯洛文尼亞）；紫外分光光度計(jì)（JENWAY Genova Nano，英國）；水平電泳槽、制膠器、PAC－300型電泳儀（Bio－Rad Technology Co，美國）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio－Rad Co，美國）；梯度PCR儀（Biomateral Incorporate，德國）；掃描電鏡（Hitachi S－4800，日本）；實(shí)時熒光定量PCR儀（ABI 7500s，美國）。

1．2 體外根尖多細(xì)菌生物膜模型的構(gòu)建

1．2．1 細(xì)菌懸液的制備

分別取標(biāo)準(zhǔn)菌株糞腸球菌、血鏈球菌和衣氏放線菌，常溫復(fù)蘇后接種于BHI固體培養(yǎng)基中，37℃厭氧工作站（920 mL／L N2、800 mL／L CO2）內(nèi)培養(yǎng)。糞腸球菌和血鏈球菌培養(yǎng)12 h、衣氏放線菌培養(yǎng)24 h后，分別挑取單菌落轉(zhuǎn)入BHI液體培養(yǎng)基中厭氧條件下培養(yǎng)。2 d后可見培養(yǎng)液內(nèi)形成細(xì)菌懸液，然后用BHI培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度使其麥?zhǔn)现禐?．5，此時細(xì)菌濃度約為1×108CFU／mL。

1．2．2 牛牙骨質(zhì)片的制備

首先用慢速切鋸將牛牙牙根切開，然后將牙根表面的牙骨質(zhì)切成大小為5 mm×5 mm的牙骨質(zhì)片；切好的牛牙骨質(zhì)片放入170 g／L EDTA液中浸泡10 min后轉(zhuǎn)入52．5 g／L次氯酸鈉（NaClO）液中浸泡30 min進(jìn)行消毒，最后121℃高溫高壓滅菌15 min，置4℃冰箱備用。

1．2．3 多細(xì)菌生物膜模型的構(gòu)建

將上述制備的牛牙骨質(zhì)片依次放入24孔板中，牙骨質(zhì)部位朝上并以消毒過的黏蠟將其固定于24孔板上；然后加入調(diào)節(jié)好濃度的衣氏放線菌菌懸液500μL，37℃厭氧培養(yǎng)2 d，再加入糞腸球菌和血鏈球菌菌懸液各500μL，搖晃混勻后，厭氧培養(yǎng)3 d，每隔1 d更換1次新鮮的BHI培養(yǎng)液。3 d后觀察可見培養(yǎng)液變渾濁，表明牙骨質(zhì)片表面已經(jīng)形成膜樣結(jié)構(gòu)。

1．3 Er：YAG激光聯(lián)合根管沖洗劑分組處理后殺菌效果的觀察

1．3．1 實(shí)驗(yàn)分組和處理

將表面已形成生物膜的牙骨質(zhì)片樣本隨機(jī)分為4個實(shí)驗(yàn)組和兩個對照組。4個實(shí)驗(yàn)組分別為A組（52．5 g／L NaClO＋Er：YAG）、B組（5 g／L NaClO＋Er：YAG）、C組［（20 g／L洗必泰（CHX）＋Er：YAG］和D組［酸性水（SAEW）＋Er：YAG］、E組（生理鹽水）和F組（52．5 g／L NaClO）。E、F組分別為陰性和陽性對照組。每組又分為3個亞組，即處理時間分別為30 s、1 min和3 min，每亞組6個樣本。處理方法：將形成生物膜的牙骨質(zhì)片隨機(jī)放入潔凈的24孔板中，以消毒好的黏蠟固定于板底，牙骨質(zhì)片上的生物膜朝上，并根據(jù)分組進(jìn)行編號。用儀器固定好Er：YAG激光的R02手柄，使其伸入到24孔板中。A、B、C、D組在含有牛牙骨質(zhì)片的板孔中分別經(jīng)各自不同處理液處理后，以Er：YAG激光分別照射30 s、1 min和3 min。E組（陰性對照組）：將牛牙骨質(zhì)片浸泡在1 mL生理鹽水內(nèi)分別處理30 s、1 min和3 min，不作激光照射。F組（陽性對照組）：將牛牙骨質(zhì)片分別浸泡在1 mL 52．5 g／L NaClO內(nèi)處理30 s、1 min和3 min，不作激光照射。

1．3．2 SEM觀察細(xì)菌的數(shù)目和形態(tài)

每組取3個樣本，PBS緩沖液沖洗2遍以去除游離的細(xì)菌；然后轉(zhuǎn)入40 g／L多聚甲醛溶液中固定12 h，取出后分別用300、500、700、800、900和1 000 mL／L的乙醇梯度脫水，其中1 000 mL／L無水乙醇脫水兩次，其他濃度脫水1次，每次15 min；脫水后干燥、噴金，SEM觀察并拍照，每例樣本隨意選取3個視野觀察根尖外生物膜的情況以及細(xì)菌形態(tài)。

1．3．3 樣本DNA的提取

取各組樣本，每組3個，PBS緩沖液清洗兩遍去除游離細(xì)菌后，用消毒刀片將各組處理后的殘留細(xì)菌盡量全部刮下；刮下的細(xì)菌放入1．5 mL離心管中，加入1 mL PBS緩沖液振蕩30 s，然后12 000 r／min離心1 min，收集細(xì)菌；利用細(xì)菌DNA試劑盒提取樣本DNA后，－20℃冰箱凍存。

1．3．4 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)糞腸球菌的非保守序列應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5．0設(shè)計(jì)糞腸球菌的特異性引物，以便對已知糞腸球菌濃度樣本進(jìn)行特異性擴(kuò)增，用得到的Ct值與細(xì)菌濃度之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其引物序列為：

E16S 72f，5＇－CGGAGTGCTTGCACTCAATTGG－3＇E16S 210r，5＇－CTCTTATGCCATGCGGCATAAAC－3＇

同時根據(jù)糞腸球菌、血鏈球菌和衣氏放線菌的16srDNA基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)3種細(xì)菌的通用PCR引物，對著3種細(xì)菌的同一段序列進(jìn)行擴(kuò)增獲得Ct值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，從而測定生物膜中的這3種細(xì)菌的總細(xì)菌數(shù)量。引物序列為：U16S 1020f，5＇－TTAAACTCAAAGGAATTGACGG－3＇U16S 1190r，5＇－CTCACGRCACGAGCTGACGAC－3＇1．3．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株提取DNA，經(jīng)普通PCR、瓊脂糖凝膠電泳、切膠，回收后的DNA片段作為實(shí)時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。用紫外分光光度計(jì)測量DNA濃度，調(diào)節(jié)DNA濃度，得到拷貝數(shù)分別為104、105、106、107、108、109／μL的DNA溶液各10μL，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3．6 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)

以各組提取的樣本DNA以及所制成的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，采用經(jīng)過優(yōu)化后確定的最佳實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時熒光定量PCR總反應(yīng)體系20μL，包括：正、反向引物各1μL（10μmol／L）、SYBR premix Ex TaqⅡ（2×）10μL、Rox Reference Dye（50×）0．4μL、DNA模板2．0μL以及去離子水6．0μL。實(shí)時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95℃30 s，1個循環(huán)；95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)。梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用糞腸球菌的特異性引物，制做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其他各組應(yīng)用通用引物，根據(jù)最后的Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系，估算細(xì)菌數(shù)量的變化。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 SEM觀察牛牙骨質(zhì)片上細(xì)菌的數(shù)目和形態(tài)

掃描電鏡下可見，A組細(xì)菌數(shù)量均較少，其中30 s時可見零星存活的細(xì)菌以及一些細(xì)菌殘屑；1 min時細(xì)菌進(jìn)一步減少；3 min時幾乎未見細(xì)菌。B組細(xì)菌殘存數(shù)量普遍比A組多，30 s時可見少量散在完整細(xì)菌；1 min時細(xì)菌發(fā)生皺縮，但數(shù)目變化不大；3 min時細(xì)菌數(shù)量進(jìn)一步減少，且形態(tài)不完整。C組細(xì)菌殘余量多，30 s時有大量殘存細(xì)菌，且形態(tài)完整；1 min時細(xì)菌數(shù)量相對減少；3 min時部分細(xì)菌的細(xì)胞壁出現(xiàn)破裂。D組30 s時可見少量細(xì)菌殘余，細(xì)菌形態(tài)完整；1min時細(xì)菌數(shù)量較30 s時減少。3min時細(xì)菌幾乎消失，僅可見少量皺縮細(xì)菌。E組3min時可見桿狀的衣氏放線菌，橢圓形的糞腸球菌以及排列成鏈狀的血鏈球菌混合交錯，鑲嵌在細(xì)胞外基質(zhì)中，在牛牙骨質(zhì)表面形成膜樣結(jié)構(gòu)。F組處理3 min后幾乎無殘留細(xì)菌（圖1）。

圖1 各組牛牙骨質(zhì)片上細(xì)菌數(shù)目和形態(tài)觀察（SEM，×5 000）

2．2 實(shí)時熒光定量PCR檢測各組樣本的細(xì)菌數(shù)量

以標(biāo)準(zhǔn)品的log值為橫軸，實(shí)時熒光定量PCR所得 Ct值為縱軸作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y＝－1．478x＋30．416，用以描述細(xì)菌數(shù)量與Ct值之間的關(guān)系（圖2）。利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各處理組所得Ct值，計(jì)算相應(yīng)的DNA拷貝數(shù)（表1）。

根據(jù)表1可知，30s時，細(xì)菌DNA拷貝數(shù)除A組與F組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）外，其他各組均明顯高于F組而又低于E組（P＜0．05）。其中B、C、D組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。

1min時，剩余細(xì)菌的DNA拷貝數(shù)A組最低，與其他幾組相比均P＜0．05；B、D、F組次之，3者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；C組較以上4組高；E組細(xì)菌DNA拷貝數(shù)最高，與其他組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。

3min時，A、B、D、F組細(xì)菌DNA拷貝數(shù)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；C組較以上4組多；E組細(xì)菌數(shù)量最多，C組和E組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 各組殘余細(xì)菌DNA拷貝數(shù)

以上結(jié)果顯示，各個處理組對于根尖外微生物膜均有一定的殺菌作用。其中A組在30s和3min時與陽性對照組的效果相當(dāng)，而在1min時效果優(yōu)于陽性對照組。B組和D組雖然30s時殺菌效果略次于F組，但在1min與3min時效果可以達(dá)到F組水平。C組殺菌效果相對上述幾組殺菌能力較弱，無法達(dá)到陽性對照組的殺菌效果，但與陰性對照組相比，仍具有一定的殺菌能力。

3 討論

造成頑固性根尖周炎的因素有很多，例如根管治療不徹底，根尖外感染，自體異物反應(yīng)，以及形成囊腫等等，普遍認(rèn)為其原因在于根尖外部形成了微生物膜［12－13］。糞腸球菌、衣氏放線菌以及血鏈球菌都是難治性頑固性根尖周炎中常被檢出的細(xì)菌［14－16］。有研究認(rèn)為，衣氏放線菌與根尖膿腫的形成密切相關(guān)［17］，血鏈球菌可以導(dǎo)致根管的程序性感染［16］，而糞腸球菌則含有脂磷壁酸、溶細(xì)胞素、肽聚糖等多種毒力因子［18］，并且具有耐受惡劣條件、耐藥等影響；這些細(xì)菌形成的生物膜具有很強(qiáng)的致病性并很難被去除。Er：YAG激光可以通過組織內(nèi)的水分吸收激光能量，在含水組織內(nèi)發(fā)生微爆破。根尖外微生物膜內(nèi)的水分含量遠(yuǎn)高于牙體硬組織，因此可以使用極低的能量去除微生物，而不破壞牙骨質(zhì)［19］。當(dāng)其與根管沖洗劑聯(lián)合應(yīng)用時，激光振蕩液體介質(zhì)沖擊波可以在固體表面產(chǎn)生剪切力，導(dǎo)致表面形變以去除表面物質(zhì)，從而進(jìn)一步提高對微生物膜的殺菌作用［7］。同時，Er：YAG激光還可以促進(jìn)根管沖洗劑中有效成分的裂解以增強(qiáng)殺菌效果。而幾種液體介質(zhì)也可以降低Er：YAG激光產(chǎn)生的熱損傷，使非接觸性照射的骨組織只有表面微層結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使骨組織損傷減少，有利于骨組織恢復(fù)［20］。兩者的聯(lián)合應(yīng)用可形成一種更有效且安全的消毒模式。

本實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組相比均表現(xiàn)出殺菌效果。其中52．5g／LNaClO聯(lián)合激光照射組的整體殺菌能力優(yōu)于陽性對照組，1min時殺菌效果強(qiáng)于陽性對照組，30s和3min時則與陽性對照組效果相當(dāng)。通常情況下，5g／LNaClO溶液需要30min以上處理才能抑制糞腸球菌的生長，52．5g／L的NaClO卻僅需30s［21］，本實(shí)驗(yàn)1min和3min時，5g／LNaClO＋Er：YAG組與陽性對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明低濃度NaClO與Er：YAG激光聯(lián)合應(yīng)用時可在短時間內(nèi)就達(dá)到高濃度NaClO液的殺菌效果，且降低了NaClO液因濃度過高可能導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，使得在口腔中的應(yīng)用更加安全。CHX能夠通過自身陽離子與細(xì)胞膜上的陰離子結(jié)合造成細(xì)菌溶解。本實(shí)驗(yàn)中C組與陰性對照組相比，起到了明顯的殺菌作用，但效果較A、B組稍弱。這可能與其僅對細(xì)胞起作用，而不能去除壞死的組織有關(guān)。但與NaClO相比，CHX因較高的生物安全性，和對羥基磷灰石的親和作用，使其可能有更廣泛的應(yīng)用［22］。SAEW是電解食鹽形成的酸性水，具有快速殺菌、毒副作用小以及無污染等優(yōu)點(diǎn)［23］。有研究表明，在根管處理中，SAEW與NaClO聯(lián)合應(yīng)用的沖洗效果與NaClO和150 g／L EDTA聯(lián)合應(yīng)用的效果相當(dāng)［24］，但Qing［25］則認(rèn)為SAEW的殺菌作用不如30 g／L NaClO。本實(shí)驗(yàn)中，SAEW聯(lián)合激光照射30 s時的殺菌能力較A、F組稍弱，但與E組相比具有明顯殺菌作用；1、3 min時則可達(dá)到NaClO組水平，有效去除根尖外的生物膜。推測可能是由于與Er：YAG激光的聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)了SAEW中自由基的產(chǎn)生，從而提高了殺菌效果。本結(jié)果表明，Er：YAG激光與根管沖洗劑聯(lián)合應(yīng)用均對體外根尖外多細(xì)菌生物膜具有有效的殺滅作用，為Er：YAG激光與根管沖洗液的聯(lián)合應(yīng)用去除根尖生物膜的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Antibacterial effect of Er：YAG laser combined w ith root canal irrigants on apicalmultispecies biofilm

YANG Yang，CHENG Xiao－gang，QIU Jun，XIAO Min，TIAN Yu，YU Qing
（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodontics，School of Stomatology，?The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To evaluate the bactericidaleffective of the Er：YAG laser combined with different irrigants on apicalmultispecies biofilm．METHODS：Actinomyces，Enterococcus faecalis and Streptococcus sanguiswere cocultured on bovine cementum slices to form multispecies biofilm．The specimens were divided into 6 groups randomly and were treated as the following：52．5 g／L sodium hypochlorite（NaClO）＋Er：YAG laser（group A），5 g／L NaClO＋Er：YAG laser（group B），20 g／L chlorhexidine（CHX）＋Er：YAG laser（group C），strong acid electrolytic water（SAEW）＋Er：YAG laser（group D），normal saline（group E，negative control），and 52．5 g／L NaClO（group F，positive control）．Each group was divided into3 subgroups（n＝6）．In each subgroup，the specimenswere treated with differentmethods for30 s，1min and 3min respectively．Scanning electronmicroscope（SEM）was used to observe the morphology ofmultispecies biofilm after treatment．Real－time quantitative PCR was used to detect the bacterial number．RESULTS：The number of bacteria in every treatmentgroup was significantly less than that in the negative control group（P＜0．05）．Group A showed the same strong bactericidal effect as the positive control group in 30 s and 3 min（P＞0．05）and stronger in 1 min（P＜0．05）．Group B and group D had similar effect on themultispecies biofilm to positive control group in 1 min and 3 min（P＞0．05），but showed less effect in 30 s（P＜0．05）．The antibacterialeffect of group C is poorer compared with other groups exceptnegative group atall time points（P＜0．05）．CONCLUSION：Er：YAG combined with different root canal irrigants can remove the apicalmultispecies biofilm effectively．

Er：YAG laser；multispecies biofilm；root canal irrigants；sodium hypochlorite（NaClO）；chlorhexidine（CHX）；strong acid electrolytic water（SAEW）［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：308］

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0308－06

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．010

2014－12－12；

：2015－03－15

楊揚(yáng)（1989－），女，漢族，山東泰安人。碩士生（導(dǎo)師：余擎）

余擎，E－mail：yuqing＠fmmu．edu．cn