楊 燚，胡成虎，張少鋒，金 巖

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院：*修復(fù)科，**組織工程研究中心，陜西西安710032）

SAMP6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能研究

楊 燚*，**，胡成虎**，張少鋒*，金 巖**

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院：*修復(fù)科，**組織工程研究中心，陜西西安710032）

目的：研究自發(fā)性老年性骨質(zhì)疏松模型SAMP6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）的衰老狀態(tài)、分化功能及線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性。方法：分離培養(yǎng)SAMP6及其對(duì)照品系SAMR1小鼠BMMSCs，分別以實(shí)時(shí)定量PCR（RT－PCR）、Western Blot及細(xì)胞染色的方法，檢測(cè)衰老、分化相關(guān)指標(biāo)，并分別檢測(cè)線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性及復(fù)合體相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照品系SAMR1小鼠相比，SAMP6小鼠BMMSCs的衰老相關(guān)基因、蛋白水平及β－gal染色陽(yáng)性率顯著升高（P＜0．05）；成骨分化相關(guān)基因、蛋白水平及茜素紅染色陽(yáng)性率顯著降低（P＜0．05）；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ活性顯著降低，且呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因表達(dá)亦降低（P＜0．05）。結(jié)論：SAMP6小鼠BMMSCs存在細(xì)胞衰老及成骨分化功能障礙，其線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能顯著下降。

SAMP6小鼠；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）；線粒體呼吸鏈復(fù)合體

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：263］

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）作為組織工程最重要的種子細(xì)胞，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。BMMSCs具有成骨、成脂、成軟骨、成肌等多向分化潛能［1］，且由于取材方便、易于分離培養(yǎng)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在干細(xì)胞治療領(lǐng)域被視為最具有臨床應(yīng)用潛力的研究對(duì)象。目前研究中BMMSCs已經(jīng)在包括心血管系統(tǒng)疾病、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)損傷乃至整形美容等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景［2］。

自發(fā)性老年性骨質(zhì)疏松模型小鼠（senescence accelerated mouse strain prone 6，SAMP6）以其早期出現(xiàn)骨密度降低、脆性增加、骨形成缺陷及全身性骨量減少等特性成為目前研究骨衰老及病理狀態(tài)下BMMSCs性質(zhì)的理想模型［3－4］。盡管越來越多的證據(jù)表明BMMSCs功能缺陷在骨質(zhì)疏松發(fā)病過程起關(guān)鍵作用［5］，目前尚缺乏對(duì)SAMP6及其對(duì)照品系SAMR1小鼠BMMSCs衰老狀態(tài)及分化能力的系統(tǒng)比較，也鮮有對(duì)其功能缺陷機(jī)制的探索。

線粒體功能缺陷被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的重要標(biāo)志之一［6］，這其中又尤以呼吸鏈復(fù)合體功能的下降為重要因素。線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生場(chǎng)所，而呼吸鏈復(fù)合體功能的下降直接導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老及功能缺陷［7］?；謴?fù)線粒體功能也因此可能成為治療年齡相關(guān)性疾病的新手段［8－9］。

本研究旨在以SAMP6骨早衰小鼠為模型，對(duì)其BMMSCs衰老狀態(tài)及成骨分化能力進(jìn)行檢測(cè)鑒定，并以對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能的研究為入口，探討造成BMMSCs功能下降，并最終引發(fā)骨形成缺陷的內(nèi)在機(jī)制，為基于恢復(fù)干細(xì)胞線粒體功能的治療方法提供依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步拓寬干細(xì)胞治療的應(yīng)用前景提供新的思路。

1 材料和方法

1．1 主要材料、試劑和儀器

SAMP6及SAMR1小鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；α－MEM培養(yǎng)液、鏈霉素、青霉素、L－谷氨酰胺（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清（杭州四季青）；維生素C、β－磷酸甘油鈉、地塞米松（Sigma，美國(guó)）；兔抗P53、兔抗P21抗體（CST，美國(guó)）；兔抗RUNX2、兔抗ALP、羊抗SP7抗體（Abcam，美國(guó)）；鼠抗β－actin抗體、抗兔二抗、抗鼠二抗、抗羊二抗（上?？禐槭兰o(jì)）；Trizol Reagent（Life Technologies，美國(guó)）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR－ⅡGreen熒光定量試劑（TAKARA，日本）；相關(guān)基因引物（上海生工）；PCR擴(kuò)增儀（BioMetra，美國(guó)）；Western及IP用細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞β－gal原位染色試劑盒、線粒體呼吸鏈復(fù)合體（Ⅰ～Ⅳ）活性檢測(cè)試劑盒（上海碧云天）；PVDF膜（DUPONT，美國(guó)）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（BIO－RAD，美國(guó)）；ECL發(fā)光試劑（上海七海生物）；Tanon圖像掃描分析系統(tǒng)（上海天能）；YJ－875型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus，日本）；CO2恒溫孵箱（Forma，美國(guó)）。

1．2 小鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)與成骨分化誘導(dǎo)及表型鑒定

1．2．1 小鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)與成骨分化誘導(dǎo)

分別取4～6個(gè)月齡的SAMP6及SAMR1小鼠，脫頸處死后于750 mL／L乙醇中浸泡消毒10～15 min；超凈工作臺(tái)內(nèi)解剖、分離小鼠股骨、脛骨，剪去兩端骨骺后，以1 mL注射器、α－MEM培養(yǎng)液（含200 mL／L胎牛血清、100 mg／mL鏈霉素及青霉素）快速?zèng)_出骨髓組織于9 cm培養(yǎng)皿中，小心吹打至無肉眼可見組織團(tuán)塊后，置于37℃、飽和濕度、50 mL／L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第3天換液以去除懸浮細(xì)胞，而后每3 d換液；待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗后，以2．5 g／L胰酶、37℃消化3～5 min后，加入等體積α－MEM培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞懸液于800 r／min離心5 min后棄去上清、計(jì)數(shù)，以2．5×104／cm2密度進(jìn)行接種傳代。對(duì)于成骨分化誘導(dǎo)，待P1代BMMSCs生長(zhǎng)至90%以上時(shí)，換用含50 mg／mL維生素C，3 g／L β－磷酸甘油鈉及4 mg／L地塞米松的完全培養(yǎng)液，每3 d換液。

1．2．2 小鼠BMMSCs的表型鑒定

分別取P3代SAMP6及SAMR1小鼠BMMSCs，消化、離心后用PBS重懸，使細(xì)胞密度為3×106／mL，并以每管100μL分裝至EP管中；按照抗體使用說明的推薦比例，分別加入適宜濃度的抗Sca－1抗體、抗CD29抗體、抗CD90抗體、抗CD34抗體及抗CD45抗體，并將每組不加抗體的空白管作為對(duì)照；4℃避光孵育40 min后，離心并棄去上清，PBS清洗細(xì)胞兩遍，以200μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)抗體標(biāo)記細(xì)胞陽(yáng)性率。

1．3 SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1．3．1 RT－PCR檢測(cè)SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs衰老相關(guān)基因表達(dá)水平

分別取生長(zhǎng)至90%的P1代SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs，以Trizol試劑提取總RNA，以RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)合成cDNA；以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參照，RT－PCR儀分別檢測(cè)兩組細(xì)胞P53及P21的mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件嚴(yán)格遵照產(chǎn)品說明，反應(yīng)體系如表1，相關(guān)引物序列見表2。

表1 RT－PCR反應(yīng)體系

表2 細(xì)胞衰老相關(guān)基因引物及其序列

1．3．2 Werstern Blot檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白水平

分別取生長(zhǎng)至90%的P1代SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs，以含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，冰上超聲裂解提取細(xì)胞總蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，每組取等量蛋白樣本進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)于PVDF膜，50 g／L牛血清白蛋白封閉液室溫封閉2 h；分別以抗P53、抗P21及抗β－actin抗體以產(chǎn)品說明推薦濃度4℃孵育過夜；以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔、鼠二抗常溫孵育2 h后，ECL發(fā)光試劑顯色，Tanon圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析和記錄。

1．3．3 衰老相關(guān)β－半乳糖苷酶（β－gal）染色

分別取P1代SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs，按照產(chǎn)品說明，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入1 mLβ－gal染色固定液，室溫固定15min；吸除固定液，PBS洗滌細(xì)胞3次后，每孔加入1 mL染色工作液，于無CO2孵箱中37℃避光孵育過夜，PBS清洗去除染色液終止染色，倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1．4 SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs成骨分化能力檢測(cè)

1．4．1 RT－PCR檢測(cè)SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平

分別取成骨誘導(dǎo)7 d的P1代SAMP6和 SAMR1小鼠BMMSCs，以RT－PCR方法檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因ALP、RUNX2、OCN及COL－1的mRNA表達(dá)水平。檢測(cè)方法與反應(yīng)體系同前，所用引物序列見表3。

表3 成骨分化相關(guān)基因引物及其序列

1．4．2 Werstern Blot檢測(cè)細(xì)胞成骨分化相關(guān)蛋白水平

分別取成骨誘導(dǎo)7 d的P1代SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs，以Werstern Blot方法檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因ALP、RUNX2及SP7的蛋白表達(dá)水平。檢測(cè)方法同前。

1．4．3 茜素紅染色

稱取14．41 g茜素紅溶解于100 mL去離子水中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，調(diào)整pH值為4．1，過濾備用；分別取成骨誘導(dǎo)14 d的P1代SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs，PBS沖洗3次，100 g／L多聚甲醛固定40 min；PBS清洗2遍，用上述茜素紅染液染色15 min，PBS洗凈染色液，倒置相差顯微鏡觀察、拍照并使用ImageJ 1．43u軟件進(jìn)行半定量分析，得到茜素紅染色陽(yáng)性面積率（%）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1．5 SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能的檢測(cè)

1．5．1 線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性檢測(cè)

以復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)為例，以蛋白裂解液分別提取P1代兩組BMMSCs總蛋白樣本并定量后，調(diào)整蛋白濃度為250μg／100μL；設(shè)定分光光度儀為波長(zhǎng)340 nm，間隔1 min，讀數(shù)3次；按照試劑盒產(chǎn)品說明分別測(cè)定各組樣本的背景對(duì)照、樣本總活性測(cè)定及樣本非特異性活性，并計(jì)算樣本特異性活性測(cè)定值。復(fù)合體Ⅱ～Ⅳ活性檢測(cè)方法與Ⅰ類似。

1．5．2 線粒體呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè)

分別取P1代的SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs，RT－PCR方法檢測(cè)呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因ATP5a、NDUFS8、ND1、Cytb及COX1的mRNA表達(dá)水平。檢測(cè)方法與反應(yīng)體系同前，所用引物序列見表4。

表4 線粒體呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因引物及其序列

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs表型鑒定

流式細(xì)胞儀對(duì)兩組細(xì)胞的表面標(biāo)記物鑒定結(jié)果顯示，P3代SAMP6小鼠BMMSCs的Sca－1陽(yáng)性率為90．5%、CD29為98．0%、CD90為97．2%；CD34陽(yáng)性率為1．2%、CD45為0．9%（圖1）。P3代SAMR1小鼠BMMSCs的Sca－1陽(yáng)性率為84．1%、CD29為94．8%、CD90為96．7%；CD34為1．0%、CD45為0．8%（圖2）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SAMP6小鼠BMMSCs表面標(biāo)記物

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SAMR1小鼠BMMSCs表面標(biāo)記物

2．2 SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs衰老相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

2．2．1 兩組細(xì)胞衰老相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SAMP6組

BMMSCs的衰老相關(guān)因子P53及P21蛋白表達(dá)水平明顯高于SAMR1組（圖3）。

圖3 兩組BMMSCs衰老相關(guān)因子蛋白水平比較

2．2．2 兩組細(xì)胞衰老相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SAMP6組BMMSCs的衰老相關(guān)因子P53及P21的mRNA表達(dá)水平均顯著高于SAMR1組（P＜0．05）（圖4）。

圖4 兩組BMMSCs衰老相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較（*與SAMR1相比，P＜0．05）

2．2．3 兩組細(xì)胞衰老相關(guān)β－gal染色結(jié)果

β－gal染色結(jié)果顯示，SAMP6組BMMSCs染色陽(yáng)性率明顯高于SAMR1組（圖5）。

2．3 SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs成骨能力的檢測(cè)

2．3．1 兩組細(xì)胞成骨分化相關(guān)蛋白水平的檢測(cè)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SAMP6組BMMSCs的成骨分化相關(guān)ALP、RUNX2及SP7水平明顯低于SAMR1組（圖6）。

2．3．2 兩組細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SAMP6組BMMSCs的成骨分化相關(guān)基因ALP、RUNX2、OCN及COL－1的mRNA表達(dá)水平均顯著低于SAMR1組（P＜0．05）（圖7）。

圖5 兩組BMMSCs衰老相關(guān)β－gal染色比較（×100）

圖6 兩組BMMSCs成骨分化相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平比較

2．3．3 兩組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果比較

圖7 兩組BMMSCs成骨分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較

茜素紅染色可見，SAMP6組細(xì)胞染色陽(yáng)性率明顯低于SAMR1組，半定量分析示SAMP6組細(xì)胞茜素紅染色陽(yáng)性面積顯著低于SAMR1組（P＜0．05）（圖8～9）。

圖8 兩組BMMSCs茜素紅染色

2．4 SAMP6和SAMR1小鼠BMMSCs線粒體呼吸鏈復(fù)合體功能檢測(cè)

2．4．1 兩組細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ活性的比較

對(duì)兩組細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性的檢測(cè)可見，SAMP6組BMMSCs的復(fù)合體Ⅰ及復(fù)合體Ⅲ活性顯著低于SAMR1組（P＜0．05），而對(duì)于復(fù)合體Ⅱ及復(fù)合體Ⅳ兩組活性無明顯差異（圖10）。

2．4．2 兩組細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SAMP6組BMMSCs的呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因ATP5a、NDUFS8、ND1、Cytb及COX1的mRNA表達(dá)水平均顯著低于SAMR1組（P＜0．05）（圖11）。

圖9 兩組BMMSCs半定量分析（*P＜0．05）

圖10 兩組BMMSCs 4種線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性比較

圖11 兩組BMMSCs呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

自Friedenstein等首次（1976）以全骨髓貼壁法成功分離以來［10］，BMMSCs以其良好的自我更新和多向分化潛能，較低的免疫原性及簡(jiǎn)便的取材方式而被視為理想的組織工程種子細(xì)胞受到廣泛關(guān)注。不僅如此，基于BMMSCs的干細(xì)胞療法也在多種疾病和損傷模型中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，BMMSCs在治療牙和牙槽骨再生，以及頜面部缺損修復(fù)等方面的研究中占據(jù)重要地位［11］，然而BMMSCs治療要實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用仍存在種種困難。由于BMMSCs在骨髓中存在比例低，取材后必須經(jīng)過體外擴(kuò)增方能獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量，這一過程是否會(huì)對(duì)BMMSCs治療活性產(chǎn)生影響尚不得而知。另一方面，自體干細(xì)胞移植療法難以保證患者自身BMMSCs的質(zhì)量，有學(xué)者認(rèn)為在老年患者應(yīng)用自體BMMSCs治療心梗的過程中，由于患者BMMSCs處于衰老狀態(tài)導(dǎo)致最終治療效果欠佳，并以此作為解釋BMMSCs治療在臨床試驗(yàn)中的效果不及在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中出色的原因［12］。這些問題使得對(duì)BMMSCs的質(zhì)量控制成為干細(xì)胞治療應(yīng)用中的新課題，也對(duì)病理狀態(tài)下BMMSCs特性的研究提出了新的要求。

近年很多研究表明BMMSCs的衰老與分化異常與骨形成缺陷和骨質(zhì)疏松發(fā)病之間存在密切聯(lián)系。自發(fā)性老年性骨質(zhì)疏松模型小鼠SAMP6在3～4個(gè)月齡即出現(xiàn)各種骨質(zhì)疏松表型［13］，這一性質(zhì)使其成為研究病理狀態(tài)下BMMSCs特性的良好模型。在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)SAMP6及其對(duì)照品系SAMR1小鼠的BMMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)并進(jìn)行細(xì)胞衰老和成骨分化能力的比較。其中，SAMP6組在細(xì)胞衰老相關(guān)因子p53及其下游p21的基因表達(dá)及蛋白水平上均顯著高于SAMR1組，同時(shí)，衰老相關(guān)β－gal染色結(jié)果也說明了SAMP6組BMMSCs的衰老狀態(tài)。另一方面，我們從成骨相關(guān)基因的表達(dá)、蛋白水平檢測(cè)及茜素紅染色等層次證實(shí)SAMP6組BMMSCs存在成骨分化能力缺陷。這些結(jié)果為BMMSCs參與骨質(zhì)疏松發(fā)病過程的觀點(diǎn)提供了依據(jù)，同時(shí)也提示恢復(fù)BMMSCs功能狀態(tài)可能對(duì)于提高其治療效果具有重要意義。

線粒體功能缺陷被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的始發(fā)因素之一，干細(xì)胞衰老和分化缺陷往往伴隨著ROS升高、線粒體膜電位降低、線粒體形態(tài)學(xué)改變等一系列變化。而作為線粒體能量代謝工廠的核心，位于線粒體膜結(jié)構(gòu)上的呼吸鏈則是造成這些功能變化的根源之一［14］。線粒體呼吸鏈由4種呼吸鏈復(fù)合體（Ⅰ～Ⅳ）及ATP合酶（也稱復(fù)合體Ⅴ）共同協(xié)調(diào)完成電子傳遞及ATP合成過程。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SAMP6和SAMR1小鼠BMMCSs呼吸鏈復(fù)合體功能的比較，發(fā)現(xiàn)SAMP6小鼠BMMCSs的呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ及Ⅲ的活性顯著低于SAMR1組。同時(shí)，我們檢測(cè)了兩組細(xì)胞中幾種代表性的呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因的表達(dá)狀態(tài)，其中包括核編碼基因NDUFS8和ATP5a，以及線粒體編碼基因ND1、Cytb和COX1。SAMP6小鼠BMMSCs中這幾種基因的表達(dá)均顯著低于SAMR1組，提示其可能存在整體轉(zhuǎn)錄水平上的呼吸鏈復(fù)合體基因表達(dá)異常，這一異常在核編碼及線粒體編碼的基因中均存在，以此導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)蛋白合成出現(xiàn)障礙，從而直接導(dǎo)致其活性的下降，引發(fā)線粒體能量合成功能障礙及ROS升高，最終導(dǎo)致BMMCSs衰老及分化功能缺陷。

線粒體呼吸鏈相關(guān)基因的表達(dá)需要多種因子協(xié)同參與共同維持。本實(shí)驗(yàn)表明衰老BMMSCs中存在線粒體呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因的表達(dá)異常，但其具體發(fā)生機(jī)制仍需探索。例如，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α（peroxisome proliferator－activated receptorγco－activator 1α，PGC－1α）通過協(xié)調(diào)其下游NRF1、2及ERRα等多種線粒體呼吸鏈復(fù)合體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控復(fù)合體相關(guān)基因表達(dá)［15］；又如核編碼的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondria transcriptional factor A，TFAM）直接調(diào)控線粒體編碼的復(fù)合體相關(guān)基因的表達(dá)［16］。以上這些因子的異常變化均可導(dǎo)致線粒體呼吸鏈相關(guān)基因表達(dá)的異常，從而導(dǎo)致復(fù)合體活性下降，因此也可能成為藥物干預(yù)調(diào)控線粒體功能的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為改善線粒體因呼吸鏈異常導(dǎo)致的功能障礙，從而為提高BMMSCs的功能和治療效果提供了新的思路。

［1］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，etal．Multilineage potential ofadulthumanmesenchymal stem cells［J］．Science，1999，284（5411）：143－147．

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Function ofm itochondrial respiration chain comp lex in bone marrow mesenchymal stem cells of SAMP6 m ice

YANG Yi，HU Cheng－Hu，ZHANG Shao－Feng，JIN Yan
（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of prosthodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To detect senescence condition，osteogenic differentiation ability and the activity of mitochondrial respiration chain complex of bone marrow mesenchymal stem cells（BMMSCs）from senescence accelerated mouse strain prone 6（SAMP6）．METHODS：BMMSCs of SAMP6 and its control strain SAMR1 mice were isolated and cultured．The cell senescence and osteogenic differentiation ability were detected by RT－PCR，Western Blot and cell staining respectively．The function ofmitochondrial respiration complex was examined by activity assay and related gene expression assay．RESULTS：Compared with control strain SAMR1，BMMSCs of SAMP6 performed increase of cellular senescence related genes and protein level，increase ofβ－gal positive cell ratio（P＜0．05），decline of osteogenic function（P＜0．05），and low activity of respiration chain complex．CONCLUSION：BMMSCs from SAMP6 perform senescence and osteogenic differentiation dysfunction with significant decline ofmitochondrial respiration chain complex．

SAMP6 mice；bonemarrow mesenchymal stem cells（BMMSCs）；mitochondrial respiration chain

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0263－07

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．002

2015－02－13；

：2015－03－24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31301062）

楊燚（1989－），男，漢族，陜西西安人。博士生（導(dǎo)師：張少鋒、金巖）

張少鋒，E－mail：sfzhang＠fmmu．edu．cn金 巖，E－mail：yanjin＠fmmu．edu．cn