馬逢樂，劉寶剛，王 娟，何欣遙，王志華，何文喜

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．第二炮兵總醫(yī)院禮士路門診部，北京100820）

ERK信號通路在人牙髓干細(xì)胞增殖與分化中的作用

馬逢樂1，劉寶剛2，王 娟1，何欣遙1，王志華1，何文喜1

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．第二炮兵總醫(yī)院禮士路門診部，北京100820）

目的：探討細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路是否參與對人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）增殖及分化過程的調(diào)控。方法：用不同濃度的ERK通路抑制劑U0126干預(yù)hDPSCs，用CCK－8法檢測細(xì)胞增殖；在礦化液誘導(dǎo)條件下，用不同濃度U0126干預(yù)hDPSCs 14 d，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，RT－PCR檢測成骨／成牙相關(guān)基因ALP、OCN、DSPP及BSP的表達(dá)；Western blot檢測U0126（25μmol／L）干預(yù)后，ERK通路活性的變化。結(jié)果：不同濃度的U0126對hDPSCs的增殖能力無顯著影響（P＞0．05）；與對照組相比，不同濃度的U0126對礦化結(jié)節(jié)的形成和成骨／成牙相關(guān)基因ALP、OCN、DSPP及BSP的表達(dá)均有抑制作用，25μmol／L U0126的抑制作用最明顯（P＜0．05）；Western blot結(jié)果顯示隨著時間的延長，p－ERK的表達(dá)量逐步增加，在加入25μmol／L U0126后，p－ERK表達(dá)量下降（P＜0．05）。結(jié)論：ERK信號通路可能不參與對hDPSCs增殖的調(diào)控，而在促進(jìn)hDPSCs成骨／成牙分化過程中起調(diào)控作用。

人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）；ERK信號通路；增殖；分化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：277］

Gronthos等［1］（2000）利用collagenaseⅠ和dispase消化法，成功的從牙髓組織中分離出了間充質(zhì)干細(xì)胞，并提出了牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的概念。研究表明，牙髓干細(xì)胞在不同的誘導(dǎo)劑作用下，可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞等多種細(xì)胞［2－3］。堿性磷酸酶（ALP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）等常被用于鑒定DPSCs分化的特異性指標(biāo)［4－5］。近年來，DPSCs作為牙齒再生的種子細(xì)胞，已成為組織工程應(yīng)用的重要細(xì)胞來源。

研究表明，干細(xì)胞的增殖和分化受到多種信號通路的調(diào)控，分子機(jī)制復(fù)雜。Wnt／β－catenin信號通路［6－7］和Notch信號通路［8］在調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化中發(fā)揮重要作用；NF－κB通路能夠調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞［9］和牙周膜干細(xì)胞［10］的成骨分化。那么，在DPSCs的增殖和分化過程中有哪些通路參與調(diào)控，目前還不清楚。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸和（或）蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。目前為止，已發(fā)現(xiàn)了 4種不同的MAPK［11］，其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase，ERK）是最早被發(fā)現(xiàn)的，且被認(rèn)為與細(xì)胞的增殖和分化相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路在調(diào)控干細(xì)胞增殖、分化過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，血管內(nèi)皮生長因子可以激活MEK／ERK通路和PI3K／Akt通路，從而促進(jìn)大鼠海馬細(xì)胞的增殖［12］；還有研究表明，IL－2可以激活ERK通路，促進(jìn)淋巴B細(xì)胞的增殖和向漿細(xì)胞的分化［13］；三氧化礦物凝聚體（MTA）能夠激活JNK和ERK通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨／成牙本質(zhì)分化［14］；但ERK信號通路是否參與人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）的增殖、分化調(diào)控，目前研究甚少。本研究通過觀察ERK通路抑制劑U0126對hDPSCs的增殖和成骨／成牙分化的影響，從而探討ERK信號通路在hDPSCs增殖和分化中的作用。

1 材料和方法

1．1 主要材料、試劑和儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；超凈工作臺（上海凈化設(shè)備有限公司）；倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)（Olympus，日本）；Real time PCR儀（ABIPrism 7500，美國）；電泳儀（BIO－RAD，美國）；紅外成像儀（Odyssey，美國）；α－MEM、Ⅰ型膠原酶、Dispase酶、胰蛋白酶（Gibco，美國）；胎牛血清（HyClone，美國）；β－甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、茜素紅（Sigma，美國）；U0126（Invivo Gen，美國）；CCK－8（南京恩晶生物）；RIPA裂解液、5×SDSPAGE Loading Buffer、β－actin單克隆抗體（北京康為世紀(jì)）；ERK單克隆抗體、p－ERK單克隆抗體（CST，美國）；PVDF膜（Millipore，美國）；細(xì)胞總RNA提取試劑盒（Omega，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real Time－PCR試劑盒（Takara，日本）；Tris、甘氨酸、吐溫－20（MP，美國）；BSA（Thermo，美國）；氯化鈉、甲醇（國產(chǎn)分析純）。

1．2 ERK通路抑制劑U0126在hDPSCs成骨／成牙分化過程中的作用

1．2．1 實驗分組及礦化誘導(dǎo)

取3代hDPSCs，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%融合時，在礦化液 （2．16 g／Lβ－甘油磷酸鈉 、0．05 g／L維生素C、0．785 g／L地塞米松）的條件下，分別加入5、10、25μmol／L的U0126作為實驗組，以含100 mL／L胎牛血清的α－MEM作為空白組，以單純礦化液誘導(dǎo)為對照組，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1．2．2 CCK－8細(xì)胞增殖情況

取3代hDPSCs，當(dāng)細(xì)胞長至約80%～90%融合時，消化離心后收集細(xì)胞，以每孔2 000個細(xì)胞接種至96孔板，每孔100μL，用不含胎牛血清的α－MEM饑餓24 h，分別加入5、10、25μmol／L的U0126，用含100mL／L胎牛血清的α－MEM作為對照，每組設(shè)置5個副孔，分別刺激1、3、5、7 d，每孔加入10μL CCK－8，37℃孵育4 h后酶標(biāo)儀檢測562 nm波長下的吸光值。

1．2．3 茜素紅染色

取3代hDPSCs，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%融合時，礦化誘導(dǎo)14 d，棄去誘導(dǎo)液用PBS漂洗3次，40 g／L多聚甲醛固定20 min，去離子水漂洗3次，茜素紅染色10 min后肉眼及倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。

1．2．4 RT－PCR檢測

取3代hDPSCs，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%融合時，礦化誘導(dǎo)14 d，棄去誘導(dǎo)液用PBS漂洗3次，用RNA提取試劑盒提取mRNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH（人磷酸甘油醛脫氫酶）作為內(nèi)參基因，并以GENE BANK數(shù)據(jù)庫設(shè)計骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）、骨唾液蛋白（BSP）、GAPDH基因的引物（具體引物序列見表1），由上海生工生物合成。按說明書進(jìn)行Real－Time PCR，每組3個副孔并重復(fù)試驗3次。

表1 實時定量PCR作用引物名稱及序列

1．3 ERK通路抑制劑U0126調(diào)控hDPSCs成骨／成牙分化的分子機(jī)制

1．3．1 實驗分組及礦化誘導(dǎo)

取3代hDPSCs，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%融合時，分別進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，分組為礦化誘導(dǎo)5、15、30、60 min，礦化誘導(dǎo)＋25μmol／L U0126，以含100 mL／L胎牛血清的α－MEM作為對照組。

1．3．2 Western Blot檢測

上述細(xì)胞棄去誘導(dǎo)液用PBS漂洗3次；加入150μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃12 000 r／min離心15 min，取上清；加入5×SDS PAGE Loadling Buffer沸水浴10 min后，80 V、30 min，120 V、1 h進(jìn)行PAGE電泳；電泳結(jié)束后2 h、200 mA冰浴轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完畢后用50 g／L的BSA室溫封閉2 h；一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次15 min；二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，每次15 min；用紅外成像儀進(jìn)行結(jié)果分析。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩兩比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 ERK信號通路抑制劑U0126對hDPSCs增殖的影響

取3代hDPSCs，CCK－8法檢測其1、3、5、7 d細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示：與對照組比較，5、10、25μmol／L U0126組細(xì)胞增殖均無明顯差異（P＞0．05）（圖1）。

圖1 CCK－8細(xì)胞增殖情況

2．2 ERK信號通路抑制劑U0126對hDPSCs成骨／成牙分化的影響

2．2．1 茜素紅染色結(jié)果

取3代hDPSCs，礦化誘導(dǎo)14 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，對照組礦化結(jié)節(jié)明顯多于空白組，而與對照組相比，實驗組礦化結(jié)節(jié)明顯減少，25μmol／L U0126組減少最明顯，而5μmol／L U0126與10μmol／L U0126組間無顯著差異（圖2），定量結(jié)果與肉眼觀察結(jié)果一致（圖3）。

2．2．2 RT－PCR檢測結(jié)果

取3代hDPSCs，礦化誘導(dǎo)14 d后，RT－PCR檢測成骨／成牙相關(guān)基因ALP、OCN、DSPP和BSP的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與空白組相比，對照組ALP、OCN、DSPP和BSP的表達(dá)均明顯上調(diào)，而除5μmol／L U0126組ALP的表達(dá)與對照組無顯著差異（P＞0．05），10μmol／L U0126與25μmol／L U0126組ALP、OCN、DSPP和BSP的表達(dá)和對照組相比均明顯下調(diào)，且以25μmol／L U0126組下調(diào)最明顯（P＜0．05）（圖4）。

2．3 ERK通路抑制劑U0126調(diào)控hDPSCs成骨／成牙分化的分子機(jī)制

取3代hDPSCs，短時間礦化誘導(dǎo)并加入ERK信號通路抑制劑U0126（25μmol／L）后，Western blot檢測ERK、p－ERK蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，隨著時間的延長，p－ERK的表達(dá)量明顯增加，并在加入抑制劑U0126后，表達(dá)量顯著下降（圖5）。

圖2 各組茜素紅染色情況

圖3 茜素紅染色定量結(jié)果

圖4 成骨／成牙相關(guān)基因的表達(dá)水平比較

圖5 ERK信號通路的蛋白表達(dá)和p－ERK相對表達(dá)量

3 討論

大量研究表明，在干細(xì)胞增殖分化過程中有多種信號途徑參與調(diào)控。而ERK信號途徑作為最早發(fā)現(xiàn)的MAPK信號通路中的一條在調(diào)控干細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用。本研究通過CCK－8、茜素紅染色、RT－PCR研究ERK信號通路抑制劑U0126對hDPSCs增殖、分化的影響，并進(jìn)一步通過Western blot來驗證ERK信號通路在hDPSCs分化過程中的激活情況。

有文獻(xiàn)表明，同型半胱氨酸能夠通過下調(diào)p－ERK的蛋白表達(dá)量來抑制神經(jīng)干細(xì)胞NSCs的增殖［15］；還有研究表明，上皮調(diào)節(jié)蛋白EREG能夠增加牙乳頭干細(xì)胞SCAPs中ERK1／2、MEK和JNK的磷酸化水平，從而促進(jìn)SCAPs的增殖［16］；多肽物質(zhì)IKVAV可以通過促進(jìn)磷酸化的MAPK／ERK和磷酸化的PI3K／Akt水平增高，來促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMMSCs的增殖，且呈濃度和時間依賴性［17］；本結(jié)果顯示與對照組相比，1、3、5、7 d不同濃度U0126刺激組的hDPSCs細(xì)胞增殖均無明顯變化（P＞0．05），表明ERK信號通路可能不參與對hDPSCs增殖的調(diào)控，這與文獻(xiàn)報道有所差別，可能與組織來源，細(xì)胞種類，所處微環(huán)境及時間等綜合因素的不同有關(guān)。

礦化結(jié)節(jié)是反應(yīng)干細(xì)胞成骨／成牙分化的重要指標(biāo)之一。本研究茜素紅染色結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組礦化結(jié)節(jié)明顯減少，25μmol／L U0126組減少最明顯，而5μmol／L U0126與10μmol／L U0126組組間無顯著差異，說明ERK通路抑制劑U0126能夠抑制hDPSCs的成骨／成牙分化。

ALP、OCN、DSPP、BSP、CollagenⅠ、DMPs等是成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，與牙髓干細(xì)胞的成骨／成牙分化密切相關(guān)，故本研究選取ALP、OCN、DSPP和BSP作為研究對象。成骨誘導(dǎo)14 d后，RT－PCR檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后，對照組的ALP、OCN、DSPP和BSPmRNA表達(dá)量均明顯上調(diào)（P＜0．05），而在加入不同濃度的ERK信號通路抑制劑U0126后，除5μmol／L U0126組ALP的表達(dá)與對照組無顯著差異（P＞0．05）外，10μmol／L U0126與25μmol／L U0126組ALP、OCN、DSPP和BSP的表達(dá)和對照組相比均明顯下調(diào)，且以25μmol／L U0126組下調(diào)最明顯（P＜0．05），這與茜素紅染色結(jié)果趨勢基本一致，說明ERK通路抑制劑U0126能夠抑制hDPSCs的成骨／成牙分化。5μmol／L U0126組ALP的表達(dá)與對照組無顯著差異，可能是因為ALP為早期的成骨分化指標(biāo)，經(jīng)14 d長時間礦化誘導(dǎo)后表達(dá)變化可能不明顯，也可能與5μmol／L的濃度較低，抑制劑效果不明顯有關(guān)。

為了進(jìn)一步驗證ERK信號通路在hDPSCs成骨／成牙分化中的作用，我們通過Western blot檢測p－ERK的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，隨著時間的延長，p－ERK蛋白表達(dá)量逐漸增加，在加入25μmol／L U0126后，表達(dá)量明顯下降（P＜0．05），進(jìn)一步說明了ERK信號通路參與調(diào)控hDPSCs的成骨／成牙分化。有文獻(xiàn)報道，醋酸氯地孕酮（CMA）能夠激活ERK信號通路，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMMSCs向成骨細(xì)胞分化且出現(xiàn)鈣沉積，而抑制BMMSCs的成脂分化［18］；在胚胎干細(xì)胞中，成纖維生長因子7能夠激活ERK／RUNX2信號通路來促進(jìn)成骨分化［19］；這些與本研究中ERK信號通路可能參與調(diào)控促進(jìn)hDPSCs的成骨／成牙分化的結(jié)果相一致。然而，Suzuki等［20］研究發(fā)現(xiàn)，ERK途徑對小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3－E1的增殖起重要作用，對其分化作用不明顯；廖清船等［21］發(fā)現(xiàn)，阻斷ERK通路后，對已分化的成骨細(xì)胞ALP活性，鈣沉積量無抑制作用，表明ERK可能只參與了該細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)；孔維霞［22］等采用骨片法培養(yǎng)C57／BL小鼠骨實質(zhì)來源的MSCs，取第4代MSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)ERK通路可能在早期有負(fù)調(diào)控作用；這些與本結(jié)果相反，可能是由于細(xì)胞種屬來源不同和抑制劑作用濃度不同造成的。本結(jié)果表明ERK信號通路可能在hDPSCs的成骨／成牙分化過程中起調(diào)控作用，而不參與對其增殖的調(diào)控。那么，是否有其他信號通路參與，它們是如何相互作用進(jìn)行調(diào)控的，還需進(jìn)一步研究討論。

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The effect of ERK signaling pathway on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells

MA Feng－le*，LIU Bao－gang，WANG Juan，HE Xin－yao，WANG Zhi－h(huán)ua，HEWen－xi
（*State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To investigate the function of ERK signaling pathway in the regulation of proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells（hDPSCs）．METHODS：hDPSCs were treated with different concentrations of the ERK signaling pathway inhibitor U0126，and the proliferation wasmeasured by CCK－8 method．The mRNA expression of ALP，OCN，DSPP and BSPwas determined by RT－PCR．Alizarin red stainingwas used to detect themineralized nodules．ERK signaling pathway activation was analyzed by Western blot．RESULTS：ERK inhibitor U0126 had no significant influence on the proliferation ofhDPSCs．U0126 inhibited osteogenic differentiation and dentinogenic differentiation as observed by Alizarin red staining．U0126，especially at25μmol／L，down－regulated the expression of ALP，OCN，DSPPand BSP．U0126 at25μmol／L significantly inhibited ERK signaling pathway activation．CONCLUSION：ERK signaling pathway is probably not involved in the proliferation of hDPSCs，but plays an important role in the osteogenic and dentinogenic differentiation of hDPSCs．

human dental pulp stem cells（hDPSCs）；ERK signaling pathway；proliferation；differentiation

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0277－06

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．004

2014－12－19；

：2015－03－30

國家自然科學(xué)基金資助（81271125，81470733）

馬逢樂（1989－），女，回族，陜西人。碩士生（導(dǎo)師：何文喜）

何文喜，E－mail：hewenxi＠fmmu．edu．cn