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NLRP3炎癥體在小鼠實驗性急性牙髓炎中的表達(dá)

2015-04-20 06:52:16王培娜王海婧蔣文凱倪龍興
牙體牙髓牙周病學(xué)雜志 2015年5期
關(guān)鍵詞:牙髓炎牙本質(zhì)牙髓

王培娜,王海婧,蔣文凱,賈 謙,倪龍興

(軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科,陜西西安710032)

·基礎(chǔ)研究·

NLRP3炎癥體在小鼠實驗性急性牙髓炎中的表達(dá)

王培娜,王海婧,蔣文凱,賈 謙,倪龍興

(軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科,陜西西安710032)

目的:了解NLRP3炎癥體在小鼠牙髓組織中的表達(dá)情況。方法:將40只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對照組及開髓6、12、24 h組(n=10),開髓組(牙髓炎模型組)采用單純髓腔開放法建立小鼠急性牙髓炎模型,并在相應(yīng)時間點處死小鼠后取材,常規(guī)組織學(xué)處理后,HE染色觀察牙髓炎癥狀況,免疫組化染色檢測NLRP3在小鼠正常和炎性牙髓組織中的表達(dá)及定位。結(jié)果:HE染色觀察見牙髓炎模型組小鼠牙髓呈現(xiàn)急性炎性反應(yīng)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn),小鼠正常牙髓組織NLRP3僅表達(dá)在成牙本質(zhì)細(xì)胞;而在炎性牙髓組織NLRP3在成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓成纖維細(xì)胞均呈陽性表達(dá)。結(jié)論:NLRP3在小鼠牙髓組織中表達(dá)并可能在急性牙髓炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

NLRP3;牙髓炎;小鼠;免疫組化

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(5):259]

機(jī)體的自我防御系統(tǒng)包括固有免疫(inherent immunity)和獲得性免疫(acquired immunity)兩種機(jī)制,當(dāng)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物等病原微生物侵入機(jī)體組織時,其固有免疫系統(tǒng)作為防御侵害的第一道屏障發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?!把装Y體(Inflammasome)”是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,能夠快速識別各種病原微生物,從而發(fā)揮免疫防御作用。NLRP3炎癥體是NLRs(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族中研究比較深入的一種炎癥因子,它是Caspase活化時的反應(yīng)平臺,而活化的Caspase-1通過調(diào)控下游分子IL-1β和IL-18的成熟和分泌[1],進(jìn)而參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。牙髓組織作為機(jī)體的一部分,是否遵循機(jī)體的固有免疫機(jī)制,通過NLRP3炎癥體來感知微生物并對其產(chǎn)生防御反應(yīng),是我們亟需研究的一個課題。本實驗通過建立小鼠實驗性急性牙髓炎模型,觀察NLRP3在小鼠牙髓組織中的表達(dá)及定位,了解NLRP3在牙髓炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用,以期為牙髓炎的治療提供新的理論依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

40 g/L水合氯醛(分析純AR,上海山浦化工有限公司);40 g/L多聚甲醛(AR-0211,北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司);兔抗小鼠NLRP3抗體(sc-66846,Abcam公司,美國);免疫組化試劑盒(SV0002,武漢博士德);實驗動物稱量用電子秤(DST671,蘇州市蘇杭科技器材有限公司);牙科高速渦輪機(jī)(TC-169,上海市通用齒材設(shè)備電子有限公司);牙科手機(jī)(PANA-AIR-S-M4,NSK,日本);體視顯微鏡(SXP-1C,上海醫(yī)光儀器有限公司);組織脫水機(jī)(TS-12U)、組織包埋機(jī)(BM-IX)、溫控?fù)破瑱C(jī)(CS-VI)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);石蠟切片機(jī)(RM2235,Leica,德國);正置顯微鏡成像系統(tǒng)(BX-43,Olympus,日本)。

1.2 實驗動物和分組

選取6周齡C57BL/6小鼠(體質(zhì)量20~25 g,雌雄各半,共40只(購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)。隨機(jī)選取30只為炎癥模型組,另外10只為正常對照組。炎癥模型組按髓腔開放時間分為6、12、24 h組(n=10);正常對照不作開髓處理。

1.3 小鼠牙髓炎模型的建立和取材

炎癥模型組30只小鼠以40 g/L水合氯醛按0.01mL/g腹腔注射麻醉后,仰位固定于小動物實驗臺,用眼科鑷撐開小鼠口腔,暴露上頜磨牙,以750mL/L乙醇消毒上頜磨牙。體視顯微鏡下用裝有1/4圓鉆的高速渦輪機(jī)在小鼠右側(cè)上頜第一、二磨牙牙合面不噴水鉆磨,待有透紅點時停止磨切,用金屬探針在透紅點加壓,形成穿髓孔后開放髓腔不作其他處理。實驗組小鼠分別在建模后6、12、24 h脫頸處死,然后將上頜第一、二、三磨牙連同部分上頜骨一并取材。正常組在建模前處死取材。

1.4 牙髓組織切片的制作和染色觀察

將標(biāo)本置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h,經(jīng)170 g/L EDTA脫鈣20 d后流水沖洗1 h;然后將其置于脫水機(jī)中逐漸脫去組織中的水分,再將組織塊置于二甲苯中透明;經(jīng)透明處理后的組織塊置于融化的石蠟中,待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋。制作5μm厚的石蠟切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡觀察。

1.5 免疫組化染色

制作3μm厚石蠟切片,常規(guī)脫蠟,梯度乙醇脫水,PBS沖洗3 min×3次;3 mL/L甲醇-H2O2室溫孵育15 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶,PBS沖洗3min×3次;1 g/L胰蛋白酶37℃孵箱消化30min以暴露細(xì)胞內(nèi)抗原,PBS沖洗3min×3次;100 mL/L胎牛血清封閉30 min后滴加NLRP3(1∶100)一抗,37℃濕盒中2 h,4℃過夜,PBS沖洗3min×5次;滴加山羊抗兔二抗(1∶200),37℃避光孵育30 min,PBS沖洗3 min×5次;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片,顯微鏡下觀察NLRP3陽性細(xì)胞。陰性對照組用PBS緩沖液代替一抗,其他同前所述,觀察正常和炎癥牙髓組織中NLRP3的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

小鼠右側(cè)上頜第一、二磨牙牙髓組織的HE切片顯示,正常對照組:牙髓腔內(nèi)牙本質(zhì)細(xì)胞層細(xì)胞排列正常,胞質(zhì)均勻淡染,炎癥細(xì)胞極少;炎癥模型組:穿髓點下方可見中性粒細(xì)胞浸潤,隨著開髓時間的延長,牙髓組織炎癥逐漸加重,牙本質(zhì)細(xì)胞層細(xì)胞排列紊亂,牙髓血管擴(kuò)張充血,血管周圍紅細(xì)胞外滲,冠髓可見少許壞死組織(圖1)。

2.2 免疫組化觀察

根據(jù)HE染色結(jié)果選擇牙髓炎特征比較明顯的12 h為代表進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果顯示,正常小鼠牙髓組織:NLRP3蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞中呈陽性表達(dá),而在牙髓成纖維細(xì)胞中表達(dá)極少,陰性對照組各類細(xì)胞中均無NLRP3表達(dá);炎性牙髓組織:排列紊亂的成牙本質(zhì)細(xì)胞及多種炎癥細(xì)胞中NLRP3均呈陽性表達(dá),炎性病灶周邊的牙髓成纖維細(xì)胞中亦表達(dá)NLRP3,而陰性對照組各類細(xì)胞均無NLRP3表達(dá)(圖2)。

圖1 對照組及炎癥模型組小鼠牙髓組織病理學(xué)觀察(HE,×200)

圖2 小鼠牙髓組織中NLRP3的表達(dá)

3 討論

牙髓炎是由于牙髓組織受到細(xì)菌感染或物理、化學(xué)因素的刺激而發(fā)生的一種炎癥性病變[2]。作為口腔常見病和多發(fā)病,到目前為止其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中仍有很多問題尚不清楚,建立一種有效的動物模型是牙髓炎研究的重要基礎(chǔ)。以往的牙髓炎模型多選用在生物進(jìn)化、組織結(jié)構(gòu)及器官形態(tài)功能與人類較為接近的猴、狗、小型豬等動物,也有選擇兔、貓、大鼠等小型動物作為實驗對象,均取得了成功。而小鼠因其體積小、口內(nèi)空間狹窄、操作困難等缺點,很少用于牙髓炎動物模型的構(gòu)建。然而作為基因敲除技術(shù)的重要載體,小鼠在牙髓炎的研究中有其他動物無法替代的作用,因此建立小鼠實驗性牙髓炎模型有著積極的意義。

根據(jù)小鼠磨牙小的特點,本實驗利用體視顯微鏡進(jìn)行單純髓腔開放法構(gòu)建小鼠實驗性牙髓炎模型。HE切片結(jié)果顯示:正常組牙髓組織中鮮有炎癥細(xì)胞,而開髓后6 h組在開髓口附近可見炎癥細(xì)胞增多;隨著時間的推移,12、24 h組炎癥反應(yīng)明顯加重,牙髓血管充血擴(kuò)張,牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂。基于上述病理變化,我們認(rèn)為構(gòu)建小鼠實驗性牙髓炎模型是一種可行的方法,為后續(xù)研究提供了可靠的動物模型。

真核生物具有復(fù)雜的免疫識別系統(tǒng),其對病原體的識別主要依賴于病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)的受體介導(dǎo),這些受體稱為模式識別受體(pattern recognion receptor,PRR)[3]。在固有免疫反應(yīng)中,正是通過PRR對PAMPs的識別來抵抗病原微生物的入侵,為機(jī)體的防御筑起了第一道防線[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),NLRs由N端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(CARD、PYD和BIR)、C端的亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(LRR)和中間部分的核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(NACHT)構(gòu)成,是細(xì)胞內(nèi)PRR中一個很大的蛋白家族[6]。能夠識別胞內(nèi)菌等細(xì)胞內(nèi)危險信號分子[7-8],并參與不同信號通路的激活[9-10],從而促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生,啟動機(jī)體固有免疫應(yīng)答。Martinon等[11]研究發(fā)現(xiàn)具有NACHT、LRR、PYD結(jié)構(gòu)域的蛋白與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)能夠形成一個多蛋白復(fù)合體,稱為“炎癥體”,而通過形成炎癥體發(fā)揮作用的分子主要有4個(NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM-2),其中NLRP3炎癥體是目前研究最多也最為明確的一個炎癥體。

本實驗結(jié)果顯示,正常小鼠牙髓組織中,成牙本質(zhì)細(xì)胞中NLRP3呈陽性表達(dá),牙髓成纖維細(xì)胞中NLRP3幾乎不表達(dá);而在炎性牙髓組織中,排列紊亂的成牙本質(zhì)細(xì)胞及多種炎癥細(xì)胞均有NLRP3表達(dá),炎性病灶周邊的牙髓成纖維細(xì)胞亦表達(dá)NLRP3。該結(jié)果進(jìn)一步證實當(dāng)病原微生物侵入牙髓組織時,非免疫的牙髓成纖維細(xì)胞活化,分泌炎性細(xì)胞因子,參與免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。而病原微生物及其產(chǎn)物是否通過NLRP3影響成牙本質(zhì)細(xì)胞,并進(jìn)一步參與反應(yīng)性牙本質(zhì)的形成,以及成纖維細(xì)胞如何被活化尚需深入研究。

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Expression of NLRP3 inflammasome in experimental acute pulpitis in m ice

WANG Pei-na,WANG Hai-jing,JIANGWen-kai,JIA Qian,NILong-xing
(State Key Laboratory of Military Stomatology,Department of Operative Dentistry and Endodotics,School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Shaanxi Key Laboratory of Stomatology,Xi′an 710032,China)

AIM:To investigate the expression of NLRP3 inflammasome in dental pulp tissues of experimental acute pulpitis inmice.METHODS:40C57BL/6Jmice were randomly divided into 4groups(n=10).Themice in control group received no treatment.The dental pulps of themice in other 3 groupswere exposed for 6,12 and 24 h,respectively.At different time points,the animalswere sacrificed and pulp tissueswere examined by HE staining.NLRP3 expression was observed by immunohistochemical staining.RESULTS:HE staining revealed acute inflammation in the pulp of experimentalmice.NLRP3 was detected in the cytoplasm of odontoblasts in normal dental pulps.In the inflammatory pulp tissues,both odontoblasts and fibroblasts expressed NLRP3.CONCLUSION:NLRP3 is expressed in the normal and inflammatory pulp tissues,and possibly plays an important role in the development of pulpitis.

NLRP3;pulpitis;mice;immunohistochemistry

R780.2

A

1005-2593(2015)05-0259-04

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.05.001

2014-12-26;

:2015-02-28

國家自然科學(xué)基金資助(81170946,81371139)

王培娜(1988-),女,漢族,河北邯鄲人。碩士生(導(dǎo)師:倪龍興)

倪龍興,E-mail:nilongx@fmmu.edu.cn

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