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牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中Oct4可變剪接體表達(dá)改變的研究

2015-04-20 06:52關(guān)麗娜孫雪飛張亞慶
牙體牙髓牙周病學(xué)雜志 2015年5期
關(guān)鍵詞:干性牙本質(zhì)牙髓

賀 瑩,關(guān)麗娜,孫雪飛,韓 冰,張亞慶,楊 帆

(軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科,陜西西安710032)

牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中Oct4可變剪接體表達(dá)改變的研究

賀 瑩,關(guān)麗娜,孫雪飛,韓 冰,張亞慶,楊 帆

(軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科,陜西西安710032)

目的:研究多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4可變剪接體在人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)向成牙本質(zhì)細(xì)胞定向分化過程中的表達(dá)改變。方法:礦化液誘導(dǎo)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化,RT-PCR檢測未經(jīng)分化誘導(dǎo)、分化誘導(dǎo)7、14 d時(shí)Oct4可變剪接體(Oct4A,Oct4B)以及干性分子Sox2、Klf4和DSPP的表達(dá)改變;激光共聚焦顯微鏡(CLSM)檢測Oct4A在分化過程中的表達(dá)和定位。結(jié)果:hDPSCs高表達(dá)CD146、CD105、CD90、CD29;CD45及CD34表達(dá)陰性。礦化液誘導(dǎo)細(xì)胞分化后牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)的總蛋白和mRNA表達(dá)陽性。在hDPSCs未經(jīng)分化誘導(dǎo)、分化誘導(dǎo)7、14 d時(shí),Oct4A和Sox2、Klf4均有表達(dá),分化誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯降低(P<0.05),14 d時(shí)hDPSCs表達(dá)均低于7 d(P<0.05);Oct4B在hDPSCs未經(jīng)分化誘導(dǎo)、分化誘導(dǎo)7、14 d時(shí)表達(dá)均為陰性;TIP110與Oct4A在hDPSCs成牙本質(zhì)分化過程中表達(dá)趨勢相同。未經(jīng)分化誘導(dǎo)hDPSCs剪接體Oct4A主要表達(dá)于細(xì)胞核,而分化誘導(dǎo)21 d后主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)論:hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中伴隨著其干性降低、剪接體Oct4A表達(dá)降低和核漿穿梭效應(yīng)的發(fā)生,提示Oct4A在維持hDPSCs干性中發(fā)揮著一定作用。

牙髓干細(xì)胞;Oct4;成牙本質(zhì)細(xì)胞分化;可變剪接體

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(5):282]

多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4(0ctamer binding transcription factor-4)是第一個(gè)被確定為調(diào)控干細(xì)胞多潛能性的核心轉(zhuǎn)錄因子,在維持胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)和體細(xì)胞重編程中發(fā)揮著重要的作用[1],已證實(shí)Oct4基因敲除小鼠缺失具有多向分化潛力的細(xì)胞群[2]。此外,在早期胚胎發(fā)育中Oct4也是決定細(xì)胞特定分化方向的重要因子。小鼠胚胎干細(xì)胞內(nèi)抑制Oct4基因表達(dá),細(xì)胞失去原有向內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化能力,分化形成滋養(yǎng)層[3]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)抑制Oct4表達(dá)可促進(jìn)中胚層發(fā)育,相反高表達(dá)則促進(jìn)內(nèi)胚層發(fā)育[4]。Oct4經(jīng)選擇性剪接可生成2種主要剪接異構(gòu)體Oct4A和Oct4B,二者組成不同,功能也不盡相同。Oct4A mRNA序列包括447個(gè)堿基對,而Oct4B mRNA序列包括344個(gè)堿基。Oct4A是Oct4的原始形式,主要表達(dá)于未分化細(xì)胞的細(xì)胞核中,參與維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)。而Oct4BmRNA序列由344個(gè)堿基構(gòu)成,表達(dá)于非多能性細(xì)胞[4-5],其作用尚不清楚。目前有關(guān)Oct4不同剪接體產(chǎn)生的機(jī)制尚未明確,有研究發(fā)現(xiàn)TIP110通過調(diào)控Oct4選擇性剪接參與維持胚胎干細(xì)胞Oct4A高表達(dá)[6]。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)屬于成體間充質(zhì)干細(xì)胞,具有多向分化和自我更新能力,位于牙髓組織血管旁的細(xì)胞龕內(nèi)。當(dāng)牙髓受到損傷時(shí),DPSCs從龕內(nèi)遷徙至受損部位分化為特定類型細(xì)胞參與牙髓損傷修復(fù)。DPSCs在未分化與分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變受到自身攜帶的遺傳信息以及周圍所處的微環(huán)境的調(diào)控[7],對比分化前后基因表達(dá)改變有助于篩選出維持細(xì)胞未分化狀態(tài)和誘導(dǎo)其定向分化的調(diào)控因子。Oct4作為轉(zhuǎn)錄因子一方面參與維持細(xì)胞未分化狀態(tài),一方面抑制分化相關(guān)特定基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)內(nèi)可檢測到Oct4、Sox2、Klf4高表達(dá),且表達(dá)隨著DPSCs的衰老降低[8],說明Oct4在hDPSCs的干性維持中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)和激光共聚焦顯微鏡檢測牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后Oct4主要可變剪接體(Oct4A和Oct4B)的表達(dá)水平和定位改變,為進(jìn)一步深入研究Oct4在hDPSCs干性維持中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和器材

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone,美國);雙抗(Gibco,美國);Dispase酶(Roche,瑞士);CD29-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD146-PE(Biolegend,美國);鼠抗人Oct4A單克隆抗體(Santa Cruz,Cat sc-5279,美國);山羊抗鼠Cy3熒光二抗(武漢博士德公司);Ⅰ型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、離心機(jī)、小鼠抗β-actin抗體(Sigma,美國);小鼠抗人DSPP抗體(Santa Cruz,sc-73632,美國);Trizol Reagent、Oct4A、Sox2、Klf4、TIP110及β-actin引物(Invitrogen,美國);細(xì)胞孵箱(Heraeus,德國);倒置相差顯微鏡(Olympus,日本);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,德國);cDNA合成試劑盒、SYBR Green試劑盒(Takara,日本)。

1.2 人牙髓細(xì)胞的分離培養(yǎng)和純化

臨床收集18~22歲新鮮拔除的健康完整的第三磨牙和因正畸需要拔除的牙齒,用帶有雙抗的PBS于超凈臺沖洗凈后,置于無菌環(huán)境中劈開取出牙髓,用含有雙抗的PBS反復(fù)沖洗3次,剪成1 mm ×1 mm×1 mm小塊,移入含有3 g/L膠原酶和4 g/L Dispase酶(1∶1)離心管內(nèi),聯(lián)合消化法37℃消化45 min,待組織塊呈絮狀加入等體積含雙抗的100 mL/L胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液終止消化,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,細(xì)胞培養(yǎng)液重懸2次后加入200 mL/L胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基,接種于35 mm的培養(yǎng)皿,37℃、50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)3 d,倒置顯微鏡下觀察組織塊周圍是否有細(xì)胞爬出,采用有限稀釋法挑選單克隆并傳代擴(kuò)增,取處于生長對數(shù)期的第4代細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.3 牙髓干細(xì)胞的鑒定

1.3.1 流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記物

2.5 g/L胰蛋白酶消化P4 hDPSCs,PBS清洗兩遍,顯微鏡下計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L,分別用CD146、CD105、CD90、CD45、CD34和CD29標(biāo)記抗體,室溫避光孵育30 min,PBS清洗3遍,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.2 礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)

hDPSCs(1×105/孔)接種于35 mm培養(yǎng)皿,等細(xì)胞融合至80%時(shí)更換培養(yǎng)液為礦化誘導(dǎo)液(含有100 mL/L FBS的α-MEM培養(yǎng)基中加入終濃度為2 ng/mL地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50 ng/mL維生素C),每3 d換液1次,誘導(dǎo)分化14 d終止礦化培養(yǎng),茜素紅進(jìn)行染色。

1.3.3 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)

hDPSCs(1×105/孔)接種于35 mm培養(yǎng)皿,等細(xì)胞融合至80%時(shí)更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液(含有100 mL/L FBS的α-MEM培養(yǎng)基中加入終濃度為0.2 mmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L胰島素、1 mmol/L地塞米松),每3 d換液1次,21 d后終止培養(yǎng),油紅O染色。

1.4 牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)的表達(dá)檢測

Western blot:礦化誘導(dǎo)液連續(xù)培養(yǎng)hDPSCs 2周,分別提取礦化0、7、14 d時(shí)總蛋白,Western blot檢測DSPP的表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)

收集未經(jīng)分化誘導(dǎo)和分化誘導(dǎo)7、14 d的牙髓干細(xì)胞,分別用Trizol試劑盒提取總RNA,分光光度計(jì)測量總RNA濃度,使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模版,使用20μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),引物設(shè)計(jì)和合成由Invitrogen公司完成,引物序列見表1。PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),包括10 min預(yù)變性,95℃變性,55℃退火,72℃延伸及最后10 min延伸。采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 免疫熒光染色

將P4代hDPSCs以1×103/孔的密度接種于24孔板內(nèi)的蓋玻片上,加入礦化誘導(dǎo)液,21 d后終止培養(yǎng),PBS清洗5 min×3次,40 g/L多聚甲醛固定30 min,PBS清洗5 min×3次,1 g/L Triton X-100通透20 min,PBS清洗3次,山羊來源的血清封閉30 min,孵一抗(1∶150),4℃濕盒過夜,PBS清洗3次,避光孵二抗2 h,PBS清洗,DAPI染細(xì)胞核,激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

鏡下見組織塊貼壁3 d后周圍有梭形細(xì)胞爬出(圖1),貼壁細(xì)胞胞體小,胞核大。換液繼續(xù)培養(yǎng)至10 d左右細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)進(jìn)行有限稀釋法挑選單克隆,經(jīng)單克隆細(xì)胞篩選擴(kuò)增后的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)記物,結(jié)果顯示,CD29、CD90、CD105、CD146呈陽性表達(dá),CD34、CD45陰性表達(dá)(圖2)。分化誘導(dǎo)14 d后,細(xì)胞呈復(fù)層生長,出現(xiàn)顆粒狀結(jié)節(jié),茜素紅染色陽性(圖3a),鏡下見大量著色的礦化結(jié)節(jié)(圖3b)。細(xì)胞成脂誘導(dǎo)21 d,油紅O染色顯示胞漿內(nèi)出現(xiàn)散在脂滴(圖3c)。

圖1 組織塊周圍細(xì)胞爬出情況(倒置顯微鏡,×10)

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記物

圖3 hDPSCs分化能力鑒定

2.2 DPSCs、成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中Oct4可變剪接體及其調(diào)控分子TIP110、干性分子(Sox2和Klf4)表達(dá)改變

Western blot結(jié)果顯示未經(jīng)礦化誘導(dǎo)的人牙髓干細(xì)胞不表達(dá)DSPP,經(jīng)礦化誘導(dǎo)7、14 d后,牙髓干細(xì)胞高表達(dá)DSPP,且隨誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)增強(qiáng)(圖4A)。qPCR結(jié)果顯示Oct4A和干性分子(Sox2,Klf4)在牙髓干細(xì)胞未經(jīng)分化誘導(dǎo),分化誘導(dǎo)7、14 d均有表達(dá),而Oct4B表達(dá)陰性,Oct4A、Sox2和Klf4隨誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)量明顯降低(P<0.05),誘導(dǎo)14 d表達(dá)低于7 d(P<0.05);Oct4可變剪接調(diào)控分子TIP110與Oct4A在牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)分化誘導(dǎo)過程中表達(dá)趨勢相同,在牙髓干細(xì)胞未經(jīng)分化誘導(dǎo),分化誘導(dǎo)7、14 d均有表達(dá),且隨誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)量明顯降低(P<0.05)(圖4B)。

2.3 DPSCs成牙本質(zhì)分化誘導(dǎo)前后Oct4A表達(dá)定位

激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)未經(jīng)分化誘導(dǎo)的hDPSC Oct4A主要位于細(xì)胞核,hDPSC成牙本質(zhì)向誘導(dǎo)分化21 d時(shí)Oct4A表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)(圖5)。

圖4 hDPSCs經(jīng)礦化誘導(dǎo)分化前后相關(guān)基因的表達(dá)

圖5 Oct4A免疫熒光染色結(jié)果(×60)

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子Oct4可與Sox2、Klf4協(xié)同共同維持干細(xì)胞多能狀態(tài),當(dāng)Oct4表達(dá)受抑制,干細(xì)胞干性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào),細(xì)胞發(fā)生分化[9]。Oct4選擇性剪接形成Oct4A、Oct4B兩種主要可變剪接體,但研究顯示只有剪接體Oct4A參與維持干細(xì)胞的全能性[10]。本研究著重觀察DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中轉(zhuǎn)錄因子Oct4可變剪接體表達(dá)改變,以初步探究Oct4可變剪接體在DPSCs干性維持中作用。本結(jié)果表明DPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中伴隨著成牙本質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記物DSPP表達(dá)增高,細(xì)胞其干性基因表達(dá)明顯降低,同時(shí)在未經(jīng)分化誘導(dǎo)DPSCs檢測到Oct4A剪接體,且誘導(dǎo)分化后表達(dá)降低,并發(fā)生胞核向胞漿轉(zhuǎn)位,但剪接體Oct4B在誘導(dǎo)DPSCs分化前后均不表達(dá)。

Oct4兩種主要可變剪接體不同的表達(dá)分布提示二者功能不同。本研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)的DPSCs表達(dá)Oct4A,但不表達(dá)Oct4B,在誘導(dǎo)DPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中伴隨干性分子Sox2和Klf4表達(dá)降低,Oct4A的表達(dá)也明顯降低,表明Oct4可變剪接體中Oct4A是真正發(fā)揮調(diào)控DPSCs干性維持的分子。Wang等報(bào)道,Oct4B對應(yīng)急狀態(tài)的細(xì)胞具有保護(hù)作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)炎癥牙髓組織中Oct4BmRNA水平顯著高于正常牙髓組織[12],提示可能與牙髓組織的免疫應(yīng)答有關(guān)。

基因mRNA水平上的可變剪接是指從一個(gè)mRNA前體中通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點(diǎn)組合)產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。研究顯示90%的人類基因會在選擇性剪接的作用下產(chǎn)生功能相同、不同甚至拮抗的多個(gè)同源異構(gòu)體(isoform),從而增加蛋白質(zhì)的多樣性。已證實(shí)單個(gè)基因選擇性剪接模式的異常即可引起細(xì)胞表性改變,發(fā)育異常和疾病。有研究提示Ⅱ型牙本質(zhì)發(fā)育不全癥(DGI-Ⅱ)的發(fā)生與牙本質(zhì)涎磷蛋白選擇性剪接位點(diǎn)基因點(diǎn)突變相關(guān),提示維持正常選擇性剪接模式是牙齒發(fā)育的重要因素[13]。Liu等報(bào)道TIP110調(diào)控Oct4的選擇性剪接,過表達(dá)TIP110可上調(diào)Oct4A的表達(dá)量,抑制TIP110表達(dá)則不能形成剪接體Oct4A,但并不影響剪接體Oct4B的形成[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)TIP110在DPSCs經(jīng)成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化與Oct4A的表達(dá)一致,提示在DPSCs內(nèi)TIP110可能參與調(diào)控Oct4可變剪接過程中Oct4A表達(dá),但機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位是調(diào)控核蛋白活性的重要機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道,多種胞核分子信號通路參與調(diào)控核蛋白胞漿轉(zhuǎn)位[14-15]。Oct4A作為轉(zhuǎn)錄因子主要位于未分化的細(xì)胞核內(nèi)以維持干細(xì)胞的全能性[16]。本實(shí)驗(yàn)熒光染色結(jié)果顯示在未經(jīng)分化誘導(dǎo)DPSCs中Oct4A主要表達(dá)在胞核,但礦化誘導(dǎo)21 d后表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì),發(fā)生胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位,也進(jìn)一步提示Oct4A在維持DPSCs未分化狀態(tài)中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)特定激酶介導(dǎo)的磷酸化調(diào)控著轉(zhuǎn)錄因子核漿穿梭的過程。Ferro等發(fā)現(xiàn)在DPSCs中絲/蘇氨酸蛋白激酶CK-II介導(dǎo)的Oct4A蛋白磷酸化程度減少是導(dǎo)致Oct4A發(fā)生胞核向胞漿轉(zhuǎn)位的主要原因[9]。Spelat等發(fā)現(xiàn)Oct4A含有6個(gè)特定的ERK磷酸化結(jié)合位點(diǎn),ERK通過磷酸化Ser111位點(diǎn)增強(qiáng)Oct4A從胞核到胞質(zhì)轉(zhuǎn)位[17]。

DPSCs干性維持是由多種基因、蛋白和外界因素共同決定的。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)DPSCs內(nèi)Oct4A通過其表達(dá)量改變和核漿穿梭效應(yīng)參與調(diào)控維持細(xì)胞未分化狀態(tài),但其調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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Expressions of Oct4 isoforms during odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells

HE Ying,GUAN Li-na,SUN Xue-fei,HAN Bing,ZHANG Ya-qing,YANG Fan
(State Key Laboratory of Military Stomatology,Department of Operative Dentistry and Endodotics,School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Shaanxi Key Laboratory of Stomatology,Xi′an 710032,China)

AIM:To examine the expression of Oct4 isoforms during odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells(hDPSCs).METHODS:hDPSCswere cultured in odontogenic inductionmedium.Expression of Oct4 isoforms(Oct4A and Oct4B),stem cellsmarkers Sox2,Klf4 and DSPPwere detected by RT-PCR.The protein location of Oct4A in hDPSC was detected by confocal laser scanningmicroscope(CLSM).RESULTS:hDPSCs positively expressed CD146,CD105,CD90 and CD29,but negatively expressed CD45 and CD34.Oct4A isoform and Sox2 and Klf4 were downregulated after odontogenic induction(P<0.05),while Oct4B isoform was not detected before and after induction of hDPSCs.TIP110 showed the same dynamic changeswith Oct4A during odontoblastic differentiation.Moreover,Oct4A was translocated from nuclear to cytoplasm after odontogenic induction.CONCLUSION:The stemness of hDPSC are reduced during odontogenic induction.Downregulation and translocation of spliced variant Oct4A indicates that itmay play a role inmaintaining stemness of hDPSC.

dental pulp stem cell;Oct4;odontoblastic induction;alternative splicing variant

R780.2

A

1005-2593(2015)05-0282-06

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.05.005

2014-12-20;

:2015-03-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81070803,81170930)

陜西省國際合作課題(2011KW-40)

賀瑩(1989-),女,漢族,陜西榆林人。碩士生(導(dǎo)師:張亞慶)

張亞慶,E-mail:Zhangyaqq@fmmu.edu.cn

楊 帆,E-mail:yangfan@fmmu.edu.cnn

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