施開創(chuàng)，鄒聯(lián)斌，胡 杰，張步嫻，莫勝蘭，官家明，陳漢忠*

(1. 廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；2. 廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

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CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV多重qRT-PCR鑒別檢測方法的建立及應(yīng)用*

施開創(chuàng)1，鄒聯(lián)斌1，胡 杰1，張步嫻1，莫勝蘭1，官家明2，陳漢忠2*

(1. 廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；2. 廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

根據(jù)豬瘟病毒(CSFV)以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因組序列特點，設(shè)計 3 對特異性引物和 3 條TaqMan 探針，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了能同時檢測并區(qū)分CSFV以及美洲型、歐洲型PRRSV的多重TaqMan熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。該方法具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性好的特點，可以特異擴增CSFV和PRRSV，而與豬的其它常見病毒無交叉反應(yīng)；對CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV3種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢出下限均為2.68拷貝/μL；組內(nèi)及組間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于1.5 %。應(yīng)用該方法對253份臨床疑似樣品進行檢測，結(jié)果病原陽性106份，其中20 份為CSFV陽性，86 份為美洲型PRRSV陽性，11 份為CSFV和美洲型PRRSV混合感染，未檢測到歐洲型PRRSV。試驗表明，研究建立的多重qRT-PCR方法可用于CSFV和PRRSV的快速鑒別檢測及流行病學(xué)調(diào)查。

豬瘟病毒；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；多重TaqMan熒光定量RT-PCR

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，以及各種年齡豬特別是仔豬嚴(yán)重呼吸道疾病為特征的一種高度接觸性傳染病。PRRSV可分為兩種基因型，即以LV株為代表的歐洲型和以VR-2332株為代表的美洲型，兩者之間基因組核苷酸序列的同源性約為60 %[1]。我國于1996年首次分離到美洲型PRRSV(NA-PRRSV)經(jīng)典株[2]，于2006年分離到以Nsp2蛋白第481位aa和第533～561位aa出現(xiàn)30個aa不連續(xù)缺失為遺傳特征的NA-PRRSV高致病性變異株(HP-PRRSV)[3]，于2011年報道致病性歐洲型PRRSV(EU-PRRSV)[4]。豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由CSF病毒(CSFV)引起豬以高熱稽留、出血、壞死和高死亡率為主要特征的一種高度接觸性傳染病。我國長期堅持使用豬瘟兔化弱毒疫苗免疫預(yù)防豬瘟，取得顯著成效，但迄今未能根除豬瘟。CSF和PRRS在我國時有發(fā)生，并且存在病原隱性感染和持續(xù)性感染的現(xiàn)象[5-6]，同時CSFV和PRRSV的繼發(fā)感染和混合感染嚴(yán)重[7]，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害。本研究針對CSFV和PRRSV基因組序列特點，設(shè)計3對特異性引物和3條TaqMan探針，建立了能同時檢測并區(qū)分CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV的多重TaqMan熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法，為CSFV和PRRSV的快速鑒別檢測提供了有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株

豬瘟病毒(CSFV)疫苗毒C株、PRRSV美洲型經(jīng)典毒株VR-2332株、變異毒株JXA1株及歐洲型疫苗毒DV株、豬偽狂犬病毒(PRV)疫苗毒Bartha-K61株、豬細小病毒(PPV)疫苗毒N株、豬口蹄疫病毒(FMDV)疫苗毒O/MYA98/BY/2010株、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)疫苗毒LG株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)試劑盒、RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細胞、Hind Ⅲ和EcoRⅠ限制酶、質(zhì)粒提取試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計與合成

參考GenBank中登錄的CSFV石門株(AY775178)及PRRSV VR-2332株(U87392)、LV株(M96262)的基因組序列，利用Primer Express 3.0 軟件包設(shè)計特異性引物和TaqMan 探針(見表1)。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 引物及探針序列

注：CSFV-5'UTR-F/R引物對擴增CSFV強毒株目的片段長度為98 bp、弱毒疫苗株目的片段長度為99 bp。

Notes: The primer CSFV-5'UTR-F/R was used to amplify 98 bp from wild-type and 99 bp from C-strain CSFV.

1.4 核酸抽提及反轉(zhuǎn)錄

取病毒液或待檢臨床樣品，按MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒使用說明，抽提總DNA/RNA。提取的總RNA，按RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒使用說明進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

以CSFV C株及PRRSV VR-2332株、DV株的cDNA為模版，分別進行PCR擴增得到99 bp、105 bp、77 bp目的片段?；厥誔CR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，陽性克隆進行PCR、酶切、測序鑒定。構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別命名為 p-C-5'UTR、p-N-ORF7和p-E-ORF7。用紫外分光光度計測定質(zhì)粒的光吸收值(OD260 nm)，計算出摩爾濃度，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)：每μL樣品中檢測基因的拷貝數(shù)=濃度(ng/μL)×阿佛加德羅常數(shù)×10-9/(660×重組質(zhì)粒堿基數(shù))。-20 ℃保存，用前稀釋。

1.6 多重qRT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

建立25 μLPCR反應(yīng)體系，分別對退火溫度(52℃～62℃)以及模板(將初始濃度為1.59×1010拷貝/μL的p-C-5'UTR、1.89×1010拷貝/μL的p-N-ORF7、3.11×1010拷貝/μL的p-E-ORF7三種重組質(zhì)粒按不同比例混合形成不同的濃度組合)、引物(將3對引物稀釋成終濃度分別為0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 pmol/μL，進行不同濃度的組合)、探針(將3條探針稀釋成終濃度分別為0.20、0.40、0.55、0.70、0.85、1.00、1.20 pmol/μL，進行不同濃度的組合)、參比染料(分別加入0.2、0.3、0.4、0.5 μL的50× Rox參比染料)的濃度進行優(yōu)化，獲得多重qRT-PCR的最佳反應(yīng)條件。

1.7 多重qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別將三種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋，將同一濃度梯度按優(yōu)化好的比例混合，使25 μL反應(yīng)體系中p-C-5'UTR、p-N-ORF7、p-E-ORF7三種質(zhì)粒的終濃度均為2.68×108～2.68×102拷貝/μL。根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件，在ABI Step one plus型PCR儀上擴增，反應(yīng)結(jié)束后計算機軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 特異性試驗

以 CSFV C 株、PRRSV VR-2332株、JXA1株、DV株以及FMDV、PRV、PPV、PCV2的cDNA或DNA為模板，進行多重qRT-PCR，鑒定其特異性。

1.9 敏感性試驗

將3種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按比例混合，使25 μL反應(yīng)體系中每種質(zhì)粒的終濃度均為2.68×106～2.68×100拷貝/μL，進行多重qRT-PCR，確定其檢出下限。

1.10 重復(fù)性試驗

將3種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-C-5'UTR、p-N-ORF7和p-E-ORF7按比例混合后，取3個濃度梯度(均為2.68×108、2.68×106、2.68×104挎貝/μL)，進行組內(nèi)及組間重復(fù)性試驗，鑒定其穩(wěn)定性。

1.11 多重qRT-PCR的應(yīng)用

應(yīng)用建立的多重qRT-PCR，對2011～2013年廣西各地送檢的疑似臨床樣品進行檢測，以評價本方法的實用性。同時應(yīng)用本實驗室建立的檢測CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV的多重 RT-PCR方法[8]對上述樣品進行檢測，分析兩種方法檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以CSFV C株、PRRSV美洲型VR-2332株、歐洲型DV株的cDNA為模版進行PCR，得到與預(yù)期目的片段大小一致的擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化，陽性克隆經(jīng)鑒定，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別命名為 p-C-5'UTR、p-N-ORF7、p-E-ORF7(見圖1)。

2.2 多重qRT-PCR最佳反應(yīng)條件的確定

經(jīng)過對退火溫度及模板、引物、探針、ROX參比染料的濃度進行優(yōu)化后，確定多重qRT-PCR 25 μL反應(yīng)體系為：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，CSFV-5'UTR-F(25 pmol/μL)、CSFV-5'UTR-R(25 pmol/μL)各0.3 μL、CSFV-5'UTR-PRRSV-P(25 pmol/μL)0.1 μL，NA-PRRSV-F(25 pmol/μL)、NA-PRRSV-R(25 pmol/μL)各0.35 μL、NA-PRRSV-P(25 pmol/μL)0.1 μL，EU-PRRSV-F(25 pmol/μL)、EU-PRRSV-R(25 pmol/μL)各1.2 μL、 EU-PRRSV-P(25 pmol/μL)1.2 μL，ROX 參比染料 0.5μL，模板(p-C-5'UTR、p-N-ORF7和 p-E-ORF7 按1:1:1比例混合)2 μL，用滅菌雙蒸水補至 25 μL。最佳反應(yīng)條件：95℃ 20 s；95℃ 1 s，56℃ 20 s，40個循環(huán)。

圖1 重組質(zhì)粒 p-C-5'UTR (A)、p-N-ORF7 (B) 和 p-E-ORF7(C) 的鑒定

2.3 多重qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按優(yōu)化好的比例混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，10倍系列稀釋成不同濃度(在25 μL反應(yīng)體系中p-C-5'UTR、p-N-ORF7和p-E-ORF7均為2.68×108～2.68×102拷貝/μL)，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進行多重qRT-PCR，得到擴增曲線(見圖2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù) r2均達到1.000，表明起始模板濃度與 Ct 值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 多重qRT-PCR的擴增曲線 圖3 多重qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.2 Dynamic curves of the multiplex quantitative TaqMan Fig.3 Standard curves of the multiplex qRT-PCR real-time RT-PCR (qRT-PCR)

2.4 特異性分析

在多重qRT-PCR 體系中，當(dāng)只加入CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV中某種病毒的cDNA作為模板時則僅能得到相應(yīng)病毒的特異性擴增曲線，當(dāng)以CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV混合cDNA為模板時則能得到三種病毒的擴增曲線，而與其他豬源病毒(FMDV、PRV、PPV、PCV2)均無交叉反應(yīng)(見圖4)，表明具有很強的特異性。

2.5 敏感性分析

以三種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物為模板，進行多重qRT-PCR時，p-C-5'UTR、p-N-ORF7和p-E-ORF7的檢出下限均為2.68 拷貝/μL(見圖5)。

圖4 多重qRT-PCR特異性試驗的擴增曲線

1. p-C-5'UTR; 2. p-N-ORF7; 3. p-E-ORF7; 4.CSFV; 5.VR-2332; 6. DV; 7.distilled water; 8.FMDV; 9.PRV; 10.PPV; 11. PCV2

圖5 多重qRT-PCR敏感性試驗的擴增曲線

圖中，僅標(biāo)示p-C-5'UTR 質(zhì)粒不同濃度的擴增曲線

Notes:Only the dynamic curves of plasmid p-C-5'UTR were marked with their corresponding concentration1: 2.68×106copies/μL; 2: 2.68×105copies/μL; 3: 2.68×104copies/μL; 4: 2.68×103copies/μL; 5: 2.68×102copies/μL; 6: 2.68×101copies/μL; 7: 2.68×100copies/μL

2.6 重復(fù)性分析

對三種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物的3個濃度梯度進行重復(fù)性試驗，結(jié)果，不同濃度的Ct 值其組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于1.5 %(見表2)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 多重qRT-PCR的應(yīng)用

利用建立的多重qRT-PCR對253份臨床樣品進行檢測，結(jié)果病原陽性106份，其中NA-PRRSV陽性86份，檢出率為33.99%；CSFV陽性20份，檢出率為7.91%；CSFV和NA-PRRSV混合感染11份，占4.35%；未檢測EU-PRRSV。部分樣品的檢測結(jié)果見圖6。同時，應(yīng)用普通多重RT-PCR方法對上述臨床樣品進行檢測，結(jié)果病原陽性86份，其中NA-PRRSV陽性71份，檢出率為 28.06%；CSFV陽性15份，檢出率為5.93%；CSFV和NA-PRRSV混合感染8份，占3.16%；未檢測到EU-PRRSV。多重qRT-PCR與普通多重RT-PCR檢測結(jié)果的符合率為92.09%，前者比后者的檢出率高。

表2 多重 qRT-PCR的重復(fù)性分析

圖6 多重qRT-PCR對部分臨床樣品的檢測結(jié)果

注：6份臨床樣品中，4、5、6、7號樣品為NA-PRRSV陽性，4和7號樣品為CSFV陽性。1 p-C-5'UTR; 2 p-N-ORF7; 3 p-E-ORF7; 4-9 臨床樣品; 10 distilled water

Notes: Of the 6 clinical samples, No. 4, 5, 6 and 7 were positive for NA-PRRSV, while No. 4 and 7 were positive for CSFV。1 p-C-5'UTR; 2 p-N-ORF7; 3 p-E-ORF7; 4-9 Clinical samples; 10 distilled water

3 討 論

當(dāng)前，NA-PRRSV經(jīng)典毒株、變異毒株以及EU-PRRSV在我國均有流行，HP-PRRSV成為優(yōu)勢毒株[9]，PRRSV流行毒株在臨床上日益復(fù)雜。CSFV的致病與流行呈現(xiàn)非典型化，主要表現(xiàn)為隱性帶毒和慢性感染，但典型豬瘟仍時有發(fā)生[10]。PRRSV和CSFV 已成為嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的兩種病原，并且繼發(fā)感染、混合感染屢見不鮮[7]。因此建立能同時檢測并區(qū)分CSFV以及PRRSV的鑒別檢測方法，對快速診斷CSF和PRRS具有重大意義。雖然有學(xué)者建立了可同時檢測CSFV和NA-PRRSV的多重RT-PCR[11-12]及多重qRT-PCR的方法[13-14]，但迄今未見報道能夠同時檢測并區(qū)分CSFV以及NA-PRRSV、EU-PRRSV的多重qRT-PCR方法。本研究根據(jù)CSFV基因組5' UTR的序列特點以及NA-PRRSV、EU-PRRSV在ORF7基因的序列差異[1]，設(shè)計了3對特異性引物和3條TaqMan探針，利用位于CSFV 5' UTR高度保守區(qū)域的1對引物和1條探針來擴增并區(qū)分CSFV，利用位于PRRSV ORF7基因的2對引物和2條探針來擴增并區(qū)分NA-PRRSV、EU-PRRSV，實現(xiàn)了在同一個擴增反應(yīng)中鑒別3種不同病毒即CSFV、NA-PRRSV、EU-PRRSV。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，成功建立了特異性強、敏感性高、重復(fù)性好的CSFV及美洲型、歐洲型PRRSV的多重qRT-PCR鑒別檢測方法，并應(yīng)用于臨床樣品的檢測，證實了其可靠性和適用性。

利用建立的多重qRT-PCR方法對253份臨床樣品進行檢測，結(jié)果NA-PRRSV檢出率為33.99 %，CSFV檢出率為7.91 %，CSFV和NA-PRRSV混合感染占4.35 %，未檢測到EU-PRRSV。表明，NA-PRRSV仍是當(dāng)前的優(yōu)勢流行毒株，是當(dāng)前防控的重點。發(fā)病豬群存在CSFV和PRRSV的混合感染和繼發(fā)感染，應(yīng)予高度重視。本研究雖未從廣西臨床樣品中檢測到EU-PRRSV，但由于該毒株已在我國存在和流行[4, 15]，因此廣西豬群依然面臨來自EU-PRRSV的巨大威脅，應(yīng)加強對EU-PRRSV的監(jiān)測。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究建立的多重qRT-PCR能夠同時檢測并區(qū)分CSFV、NA-PRRSV、EU-PRRSV，且具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性好的特點，可用于CSFV及PRRSV的快速鑒別檢測及流行病學(xué)調(diào)查。

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Establishment and Application of Multiplex qRT-PCR for Differential Detection of CSFV and North American and European PRRSV

SHI Kai-chuang1, ZOU Lian-bin1, HU Jie1, ZHANG Bu-xian1, MO Sheng-lan1, GUAN Jia-ming2, CHEN Han-zhong2*

(1.GuangxiProvincialCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Nanning,Guangxi530001,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi530005,China)

A multiplex quantitative TaqMan real-time RT-PCR (qRT-PCR) assay was established for differential detection of classical swine fever virus (CSFV) and North American (NA) and European (EU) genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) under optimized reaction condition using the three pairs of specific primers and three TaqMan probes designed according to the different genomic sequences among CSFV, NA-PRRSV and EU-PRRSV. The assay proved specifical,sensitive and reproducible, and helped amplify CSFV, NA-PRRSV and EU-PRRSV and meanwhile restraining from cross reaction with other important porcine pathogens. Detection limit of CSFV, NA-PRRSV and EU-PRRSV, all was 2.68 copies/μL ,respectively; variable coefficient was less than 1.5 percent in both intra-and inter-assay. The established assay was used to detect CSFV and PRRSV in 106 of the 253 clinical samples detected following the assay revealed positive, among which 20 samples were positive for CSFV, 86 samples for NA-PRRSV, 11 for both while none for EU-PRRSV. The results indicated that this assay could be used as an effective tool for rapid detection and epidemic surveillance of CSFV and PRRSV．

classical swine fever virus (CSFV); porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV); multiplex quantitative TaqMan real-time RT-PCR (multiplex qRT-PCR)

2014-02-07，

2014-03-27 [基金項目] 廣西科學(xué)基金項目(桂科青0832057)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(桂科轉(zhuǎn)14125004-22)

施開創(chuàng)(1968-)，男，廣西隆安人，研究員，博士，研究方向：動物疫病診斷與防控技術(shù)。E-mail:shikaichuang@126.com

*[通訊作者] 陳漢忠(1955-)，男，廣西北流人，教授，博士，研究方向：動物疫病防治，E-mail: chenhanz211@sohu.com

S811.6

A

1005-5228(2015)03-0063-006