趙強(qiáng)忠 馮夢瑩 林戀竹 趙謀明

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院, 廣東 廣州 510640)

牛大力糖蛋白的分離、鑒定及抗氧化活性*

趙強(qiáng)忠 馮夢瑩 林戀竹 趙謀明?

(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院, 廣東 廣州 510640)

為深入了解牛大力糖蛋白的結(jié)構(gòu)組成、理化性質(zhì)和生物活性,根據(jù)牛大力粗糖蛋白(MSCG)的分子質(zhì)量分布情況,采用超濾、凝膠柱層析(Sephadex G-75)、反相C-18色譜柱層析(ODS)方法,對牛大力粗糖蛋白進(jìn)行分離純化,得到兩種組分MSCG-1和MSCG-2.通過HPLC、GC、GC-MS、紅外光譜等方法對兩種組分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定.結(jié)果表明:MSCG-1的分子質(zhì)量約為62.0 ku,MSCG-2的分子質(zhì)量約為1.94 ku;MSCG-1含50.22%的蛋白質(zhì)和38.07%的糖,糖鏈主要由→4,6)-Galp-(1→和Araf-(1→構(gòu)成;MSCG-2含69.37%的蛋白質(zhì)和6.70%的糖,糖鏈由→6)-Glcp-(1→構(gòu)成主鏈,糖鏈分支度高;MSCG-1和MSCG-2中都含有O-糖肽鍵.MSCG-2中含有的可能對抗氧化有貢獻(xiàn)的氨基酸總量比MSCG-1中的高31.3%;MSCG-1和MSCG-2的氧自由基吸收能力分別為(56.10±18.49)和(1 077.19±60.82) μmol/g;MSCG-2的抗氧化活性明顯高于MSCG和MSCG-1,說明糖蛋白的分子組成、分子質(zhì)量大小及結(jié)構(gòu)特性決定了其抗氧化活性.

牛大力;糖蛋白;分離;純化;結(jié)構(gòu)鑒定;抗氧化劑

牛大力(MillettiaSpeciosaChamp.)為蝶形花科雞血藤屬,其干燥根可入藥,性味甘、平,具有補(bǔ)虛潤肺、強(qiáng)筋活絡(luò)等功用,藥用歷史悠久,臨床上證明其對多種慢性疾病(如腰痛、腎虛帶下、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、慢性肝炎、病后體虛等)有治療作用[1].近年來的研究表明,牛大力具有提高免疫、抗氧化、祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘及保肝作用[2].

目前對牛大力的研究主要集中在種植、培養(yǎng)等方面,對其含有的有效成分的結(jié)構(gòu)、活性研究則較少.對牛大力水提物的研究主要包括牛大力多糖的提取、部分活性探討及初步的結(jié)構(gòu)鑒定,對牛大力醇提物的研究則主要集中在結(jié)構(gòu)鑒定方面.

糖蛋白具有廣泛的生物活性和復(fù)雜的結(jié)構(gòu),目前尚未見有關(guān)牛大力糖蛋白的研究報(bào)道.文中重點(diǎn)研究牛大力糖蛋白的分離純化方法,進(jìn)一步對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定,并初步探討了其抗氧化活性,以期為牛大力資源的開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料與試劑

以海南野生牛大力塊根為原料.

主要試劑如下:水溶性維生素E(Trolox)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、熒光黃(Fluorescein)、各單糖標(biāo)準(zhǔn)品、肌醇,購于美國Sigma-Aldrich公司;Sephadex G-75凝膠、十八烷基硅膠(ODS),購于GE Healthcare Life Science公司;三氟乙酸、冰乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、鹽酸羥胺、吡啶、二氯甲烷、醋酸酐、二甲基亞砜、碘甲烷、硼氫化鈉、無水硫酸鈉,均為分析純;甲醇,色譜純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛大力粗糖蛋白的制備工藝

牛大力塊根干燥后,切片粉碎,過60目篩.粉末按照1∶6的料液比(質(zhì)量(g)與體積(mL)的比例)加入95%乙醇微沸回流提取3 h以脫脂、脫色.趁熱過濾,留下殘?jiān)?置烘箱中于50 ℃干燥并除去殘留乙醇.經(jīng)脫脂脫色后的牛大力塊根粉末用超聲輔助熱水提取糖蛋白,條件如下:超聲時間30 min,料液比1∶20,超聲功率800 W,提取溫度55 ℃.經(jīng)抽濾得到牛大力提取液,提取液經(jīng)50 ℃減壓濃縮至一定體積后,用Sevage法除去游離蛋白質(zhì).將除去游離蛋白后的提取液加入4倍體積的無水乙醇,冷藏靜置后得到沉淀,離心除去上清液,經(jīng)冷凍干燥得到淡黃色粗糖蛋白粉末,命名為MSCG.

1.2.2 牛大力糖蛋白的分離純化工藝

使用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾膜分離MSCG,得到截留液與透過液.截留液經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析分離,將去離子水洗脫的第一個峰命名為MSCG-1;透過液經(jīng)反相C-18色譜柱層析(ODS)分離,將10%乙醇洗脫組分命名為MSCG-2.

1.2.3 純度鑒定

[3]方法,通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對牛大力糖蛋白進(jìn)行純度檢驗(yàn).其中分離膠和濃縮膠的含量分別為150和50 g/L,采用考馬斯亮藍(lán)染色.

1.2.4 分子質(zhì)量測定

采用高效液相色譜(HPLC)法測定分子質(zhì)量.色譜柱為TSK-G2000SWXL,檢測器為示差檢測器,流動相為加1‰ TFA的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L),進(jìn)樣量為10 μL,流速為1 mL/min.以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對數(shù)(lgM)及保留時間(t)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示.

1.2.5 基本成分測定

蛋白含量測定參照GB 5009.5—2003[4],采用凱氏定氮法.總糖含量測定采用苯酚-硫酸法[5],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品.

1.2.6 氨基酸分析

采用A300自動氨基酸分析儀測定樣品氨基酸組成[6].樣品經(jīng)6 mol/L鹽酸在110 ℃下水解后用HPLC進(jìn)行分析.測定條件為:membraPureT259鈉離子交換柱,反應(yīng)器溫度為115 ℃,流動相速度為160 μL/min,茚三酮溶液流速為80 μL/min,進(jìn)樣體積為20 μL;采用雙可見光光度計(jì)檢測器,在570和440 nm處進(jìn)行檢測.

圖1 HPLC測定分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.7 單糖組成分析

參照Guerrant等[7]報(bào)道的糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法,并稍作修改,來分析單糖組成.取50 mg樣品加入10 mL 4 mol/L的三氟乙酸中,110 ℃下水解2 h后用甲醇洗滌3次,減壓濃縮干燥.再加入10 mg鹽酸羥胺、1 mg肌醇和2 mL吡啶,90 ℃下反應(yīng)30 min后繼續(xù)加入2 mL醋酸酐,90 ℃下反應(yīng)30 min,最后加入2 mL蒸餾水終止反應(yīng).用二氯甲烷萃取反應(yīng)液,取二氯甲烷相,加入無水硫酸鈉除水,用0.22 μm微孔濾膜過濾后使用7890A氣相色譜儀檢測.測定條件為:HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);采用20 PSI恒壓模式;進(jìn)樣口采用不分流模式,溫度為250 ℃;氫氣、空氣和氮?dú)饬魉俜謩e為30、400和25 mL/min;進(jìn)樣體積為1 μL.

1.2.8 糖苷鍵連接方式分析

糖苷鍵的分析參照Dong等[8]的方法并稍作修改.取50 mg樣品,加入5 mL二甲基亞砜(DMSO)超聲處理30 min.繼續(xù)加入200 mg NaOH,超聲處理30 min.加入3 mL碘甲烷,避光反應(yīng)12 h.反應(yīng)結(jié)束后用氯仿萃取甲基化反應(yīng)液,取氯仿相,減壓濃縮至干.加入5 mL 4 mol/L的三氟乙酸,110 ℃下水解2 h后,用甲醇洗滌3次,旋干.向水解物中加入4 mL蒸餾水,用NaOH調(diào)節(jié)pH至10～12.加入20 mg硼氫化鈉,室溫下反應(yīng)8～12 h.反應(yīng)結(jié)束后用乙酸調(diào)節(jié)pH至中性,減壓濃縮至干,再用甲醇洗滌3次.加入2 mL吡啶和2 mL醋酸酐,90 ℃下反應(yīng)30 min后,加入2 mL蒸餾水終止反應(yīng).用二氯甲烷萃取反應(yīng)液,取二氯甲烷相,加入無水硫酸鈉除水,用0.22 μm微孔濾膜過濾后,使用Trace DSQ-Ⅱ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測.測定條件如下:TR-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm規(guī)格的彈性毛細(xì)管柱;進(jìn)樣口溫度為250 ℃;載氣為氦氣,流量為1 mL/min,分流比為10∶1.質(zhì)譜條件如下:傳輸線溫度為280 ℃;離子源溫度為250 ℃;電子能量為70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z為30～650;進(jìn)樣體積為1 μL.

1.2.9 糖肽鍵分析

通過β-消去反應(yīng)測定牛大力糖蛋白中的O-糖肽鍵[9].稱取1.5 mg樣品溶解于0.2 mol/L氫氧化鈉溶液中,另取1.5 mg樣品溶解于蒸餾水中作為對照,在45 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min.用全波長掃描儀測定樣品在220～300 nm波段的吸收值.

1.2.10 紅外光譜分析

紅外光譜分析參照Kumar等[10]的溴化鉀壓片法.將2～4 mg冷凍干燥后的糖蛋白樣品與適量溴化鉀混勻、研磨,將粉末裝入壓片機(jī)壓成薄片.薄片用紅外光譜儀掃描,掃描波長為400～4 000 cm-1.

1.2.11 氧自由基吸收能力(ORAC)測定

ORAC測定參考文獻(xiàn)[11]的方法并作適當(dāng)修改.在96孔板各微孔中分別加入20 μL 0.05 mg/mL的糖蛋白樣品、20 μL pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液和20 μL 7 nmol/L的熒光素溶液,在37 ℃下孵育15 min后,再用多道移液器迅速在各孔中加入140 μL 12 mmol/L的AAPH啟動反應(yīng),維持溫度為37 ℃,于酶標(biāo)儀中反應(yīng)2 h,每2 min測定一次熒光強(qiáng)度.熒光測定的激發(fā)波長為485 nm,發(fā)射波長為538 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 牛大力糖蛋白的分離純化結(jié)果

2.1.1 牛大力粗糖蛋白的超濾分離結(jié)果

由圖2所示的HPLC圖譜可以看出,牛大力粗糖蛋白MSCG主要由兩部分組成,分別是分子質(zhì)量大于10 ku的組分和分子質(zhì)量為1～3 ku的組分.由于兩組分的分子質(zhì)量差異較大,因此選用超濾法進(jìn)行第一步的分離純化工作.經(jīng)超濾分離后,透過液部分均為分子質(zhì)量在1～3 ku之間的組分;而截留液保留了全部的分子質(zhì)量大于10 ku的組分,但有少量1～3 ku的組分殘留.因此,超濾法對牛大力粗糖蛋白的初步分離起到了較好的效果.

圖2 MSCG及其超濾液的HPLC圖譜

2.1.2 截留液的凝膠柱層析分離純化結(jié)果

由超濾實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,牛大力糖蛋白截留液仍含有一些小分子物質(zhì),需進(jìn)一步純化除去.經(jīng)填料篩選后,采用Sephadex G-75進(jìn)行柱層析,洗脫液為去離子水.由洗脫曲線(如圖3所示)可知,蛋白峰與糖峰基本重合,推測樣品是蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合物.第一個峰為分子質(zhì)量大于10 ku的糖蛋白,峰的對稱性較好,說明物質(zhì)較為均一.收集此峰,減壓濃縮后冷凍干燥,命名為MSCG-1.

圖3 截留液的Sephadex G-75洗脫曲線

Fig.3 Elution curves of the trapped fluid on Sephadex G-75 column

2.1.3 透過液的反相色譜柱層析分離純化結(jié)果

牛大力糖蛋白透過液用ODS柱層析,分別用2%、5%、10%、15%、20%、25%、50%乙醇洗脫,收集洗脫液.其中10%乙醇洗脫組分在HPLC檢測(檢測條件見1.2.4節(jié))中呈單一對稱峰,說明組分較純,故命名為MSCG-2,供后續(xù)研究.

2.2 糖蛋白純度鑒定與分子質(zhì)量測定結(jié)果

2.2.1 電泳結(jié)果分析

圖4為MSCG以及純化后的牛大力糖蛋白組分MSCG-1、MSCG-2的電泳條帶圖.可以看出,MSCG成分較雜,主要集中在凝膠中上部和凝膠下部,說明其中既含有分子質(zhì)量較大的物質(zhì),又含有分子質(zhì)量較小的物質(zhì).MSCG-1在凝膠中部形成一個明顯的條帶,在其余部分基本不顯色,說明組分較純.MSCG-2在凝膠下部形成一個明顯的條帶,說明MSCG-2富集了MSCG中小分子的糖蛋白,組分也比較純.電泳結(jié)果表明,所采用的分離純化方法能較好地純化牛大力糖蛋白.

2.2.2 分子質(zhì)量測定結(jié)果

采用高效液相色譜法分析MSCG-1和MSCG-2的分子質(zhì)量.以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量及保留時間做標(biāo)準(zhǔn)曲線,將樣品的出峰時間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品的分子質(zhì)量.計(jì)算得到MSCG-1的分子質(zhì)量約為62.0 ku,MSCG-2的分子質(zhì)量約為1.94 ku.由圖5所示牛大力純化糖蛋白的分子質(zhì)量分布圖可以看出,MSCG-1與MSCG-2都是較為對稱的單峰.此結(jié)果與電泳結(jié)果一致,表明牛大力粗糖蛋白經(jīng)純化后得到的兩種組分都是成分較為均一的物質(zhì).

圖5 MSCG-1和MSCG-2的分子質(zhì)量分布

2.3 基本成分分析

表1列出了MSCG、MSCG-1和MSCG-2的蛋白與總糖含量.分析表中結(jié)果可知:MSCG-1是一種糖含量相對較高的糖蛋白,蛋白含量為50.22%,總糖含量為38.07%,二者之比為1.32∶1;而MSCG-2中的主要成分是蛋白質(zhì),含量為69.37%,總糖含量為6.70%,二者之比為10.35∶1.可見,這兩種純化糖蛋白除分子質(zhì)量差異較大外,成分差異也較大.

表1 MSCG、MSCG-1和MSCG-2的蛋白與總糖含量

Table 1 Protein and carbohydrate contents of MSCG,MSCG-1 and MSCG-2

組分含量/%MSCGMSCG-1MSCG-2蛋白質(zhì)51.10±1.5350.22±1.8269.37±1.55總糖15.58±0.5338.07±0.806.70±0.74

2.4 氨基酸組成分析

采用氨基酸分析儀對各樣品中的氨基酸組成進(jìn)行分析,結(jié)果如表2所示.可以看出,MSCG-1與MSCG-2的氨基酸組成差異很大.MSCG-1中天冬氨酸含量最高,占氨基酸總量的12.9%,其次是谷氨酸、絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸和蘇氨酸,在總氨基酸中的占比均在7%～9%之間.MSCG-2中含量最高的氨基酸是脯氨酸,其在總氨基酸中的占比高達(dá)26.1%,其次是半胱氨酸,占比為20.7%,這兩種氨基酸幾乎占總氨基酸的50%.

表2 MSCG、MSCG-1和MSCG-2的氨基酸組成

Table 2 Amino acid composition of MSCG,MSCG-1 and MSCG-2

氨基酸名稱氨基酸含量/(mg·g-1)MSCGMSCG-1MSCG-2酪氨酸21.326.031.6苯丙氨酸17.637.23.2組氨酸17.316.99.4半胱氨酸102.0—155.0丙氨酸48.837.586.8纈氨酸17.746.01.1亮氨酸30.152.628.2天冬氨酸70.675.422.8谷氨酸64.454.0116.0賴氨酸16.324.71.6精氨酸16.317.635.4脯氨酸103.247.9195.0蘇氨酸19.144.813.9絲氨酸39.653.846.5甘氨酸8.324.8—異亮氨酸15.525.10.7總氨基酸608.1584.3747.1抗氧化氨基酸158.280.1199.2疏水性氨基酸96.6136.1116.1酸性氨基酸135.0129.4138.8可能對抗氧化有貢獻(xiàn)的氨基酸389.8345.6454.1

研究表明,肽鏈中氨基酸的種類與連接方式直接決定肽的生物活性.對于抗氧化活性肽來說,氨基酸組成極大地影響其抗氧化活性.不同的氨基酸抗氧化機(jī)理也不相同,有些氨基酸本身就具有抗氧化活性,可充當(dāng)親核試劑或螯合金屬離子,如組氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等[12];有些氨基酸具有疏水性,其分子結(jié)構(gòu)與表面活性劑類似,在水溶性和油溶性體系中起抗氧化作用,如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸[13];酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)也有抗氧化活性,這可能與其側(cè)鏈羧基螯合金屬離子有關(guān)[14].由表2分析可知,MSCG-2中含有的可能對抗氧化有貢獻(xiàn)的氨基酸總量比MSCG-1中高31.3%,尤其是其中的抗氧化氨基酸含量約為MSCG-1的2.5倍.

2.5 單糖組成分析

采用氣相色譜法測定各糖蛋白樣品的單糖組成,結(jié)果列于表3.由表3可知,MSCG-1和MSCG-2中均含有自然界中常見的7種單糖.但是巖藻糖在MSCG中未被檢測到,在MSCG-1和MSCG-2中的含量(以摩爾分?jǐn)?shù)表示,下同)也很低,均不到2%.分析其原因,有可能是在分離純化過程中,MSCG中的巖藻糖被富集,因而在純化糖蛋白中被檢出.顯然,MSCG-1和MSCG-2的單糖組成差異很大.MSCG-1中阿拉伯糖含量最高,達(dá)到41.13%,其次是半乳糖,為34.77%,其余單糖含量均不高,鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為1.27∶25.55∶1.16∶1.00∶4.12∶7.42∶21.60;MSCG-2則主要由葡萄糖構(gòu)成,含量高達(dá)75.84%,其余單糖含量均低于10%,鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩爾比為1.84∶5.35∶1.17∶1.00∶3.13∶48.62∶3.00.

鄭元升[15]和陳蓉蓉等[16]對牛大力多糖的單糖組成進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)牛大力多糖主要由葡萄糖和果糖組成,并含有少量的半乳糖、甘露糖和鼠李糖.文中并未從牛大力糖蛋白中檢測到果糖,但是檢測到了阿拉伯糖、巖藻糖和木糖,可能是因?yàn)榕４罅μ堑鞍字械膯翁墙M成與牛大力多糖的單糖組成存在差異.

表3 MSCG、MSCG-1和MSCG-2的單糖組成分析

Table 3 Monosaccharide composition of MSCG,MSCG-1 and MSCG-2

標(biāo)準(zhǔn)單糖摩爾分?jǐn)?shù)/%MSCGMSCG-1MSCG-2鼠李糖12.672.052.87阿拉伯糖13.5841.138.34巖藻糖—1.861.83木糖1.351.611.56甘露糖8.766.644.88葡萄糖56.8811.9475.84半乳糖6.7734.774.68

2.6 糖苷鍵連接方式分析

由表4結(jié)果可知,MSCG-1中主要糖苷鍵類型是→4,6)-Galp-(1→和Araf-(1→,主要的結(jié)構(gòu)單元是Galp(占42.4%)和Araf(占31.3%)殘基.1→4,6連接的半乳糖占比高達(dá)33.9%,說明MSCG-1可能是以半乳糖為主鏈,并且支鏈較多.末端殘基阿拉伯糖含量高達(dá)25.2%,說明支鏈可能主要由阿拉伯糖構(gòu)成.此外,葡萄糖和甘露糖殘基含量也較高.綜上所述,MSCG-1中的糖鏈由1→4,6連接的半乳糖構(gòu)成主要骨架,大量阿拉伯糖分布在支鏈中,并含有一定比例的→6)-Manp-(1→和→6)-Glcp-(1→.

表4 MSCG-1和MSCG-2的甲基化分析

不同于MSCG-1,MSCG-2中最主要的結(jié)構(gòu)單元是Glcp殘基,總含量高達(dá)69.6%,遠(yuǎn)高于其他結(jié)構(gòu)單元.主要的糖苷鍵類型為→6)-Glcp-(1→和→4,6)-Glcp-(1→.葡萄糖連接方式多樣,并且從鍵型來看,糖鏈分支度很高.綜合分析,MSCG-2中的糖鏈很有可能是由1→6連接的葡萄糖構(gòu)成主鏈,分支度高,且含有一定的Araf、Manp與Galp結(jié)構(gòu)單元.

2.7 糖肽鍵分析

當(dāng)糖鏈以O(shè)-糖肽鍵的形式與絲氨酸和蘇氨酸結(jié)合時,經(jīng)稀堿處理(β-消去反應(yīng))后,糖肽鍵發(fā)生解離,解離后的絲氨酸和蘇氨酸會形成α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸,這兩種氨基酸在紫外240 nm處有特征吸收.因此測定樣品在稀堿處理前后240 nm處吸收的變化就可判斷該樣品中是否含有O-糖肽鍵.

圖6為MSCG、MSCG-1和MSCG-2稀堿處理前后的紫外掃描光譜,堿處理后3個樣品在240 nm處都有明顯的吸收,說明3個樣品中都含有O-糖肽鍵.

圖6 堿處理前后的紫外掃描光譜

Fig.6 Ultraviolet scanning spectrograms before and after alkali treatment

2.8 紅外光譜分析

圖7顯示,MSCG在4 000～400 cm-1區(qū)間有糖類物質(zhì)和蛋白類物質(zhì)的特征吸收峰.其中:1 643 cm-1處是乙?；恤驶纳炜s振動和非對稱伸縮振動峰,以及N—H的變角振動峰,1 552 cm-1處是肽鏈上酰胺基NH2的特征吸收峰,這兩處吸收峰是蛋白類物質(zhì)的典型吸收峰;3 360 cm-1處的寬峰為O—H的伸縮振動峰,屬于分子內(nèi)氫鍵的吸收,2 962 cm-1處是甲基、亞甲基等烷基C—H的伸縮振動峰,這兩處吸收峰則是糖類物質(zhì)的典型吸收峰;1 412 cm-1處是甲基、亞甲基的面內(nèi)變角振動峰;1 107 cm-1附近相對較強(qiáng)的吸收峰表明了吡喃型糖環(huán)的存在;881 cm-1處較弱的吸收峰是β-型糖苷鍵的特征吸收峰.

圖7 MSCG、MSCG-1和MSCG-2的紅外光譜

MSCG-1也含有糖類和蛋白質(zhì)類的特征吸收峰.其中:1 650 cm-1處是乙?；恤驶纳炜s振動和非對稱伸縮振動峰,以及N—H的變角振動;1 538 cm-1處是肽鏈上酰胺基NH2的特征吸收峰;3 291 cm-1處的寬峰為O—H的伸縮振動峰;2 962 cm-1處是甲基、亞甲基等烷基C—H的伸縮振動峰;1 408 cm-1處是甲基、亞甲基的面內(nèi)變角振動峰.與MSCG的紅外光譜不同,MSCG-1在1 029、1 079 cm-1處有兩個明顯而尖銳的吸收峰,這是吡喃環(huán)的特征峰;881 cm-1處較弱的吸收峰是β-型糖苷鍵的特征吸收峰.

MSCG-2也含有糖類和蛋白質(zhì)類的特征吸收峰.其中:1 650 cm-1處是乙?；恤驶纳炜s振動和非對稱伸縮振動峰,以及N—H的變角振動;1 540 cm-1處是肽鏈上酰胺基NH2的特征吸收峰;3 352 cm-1處的寬峰為O—H的伸縮振動峰;2 938 cm-1處是甲基、亞甲基等烷基C—H的伸縮振動峰;1 407 cm-1處是甲基、亞甲基的面內(nèi)變角振動峰;1 107 cm-1附近相對較強(qiáng)的吸收峰表明了吡喃型糖環(huán)的存在.不同的是,MSCG-2除在907 cm-1有β-型糖苷鍵的特征吸收峰外,在828 cm-1處還有α-型糖苷鍵的特征峰,說明MSCG-2富集了含有α-型糖苷鍵的糖鏈.

綜上所述,MSCG、MSCG-1和MSCG-2的紅外光譜都表現(xiàn)出糖類和蛋白質(zhì)類的特征吸收,三者的官能團(tuán)種類基本類似,但是含量有所不同.

2.9 氧自由基清除能力

由圖8可知,經(jīng)分離純化后得到的兩個牛大力純化糖蛋白MSCG-1和MSCG-2的ORAC值(以μmol Trolox/g計(jì))差異很大.MSCG-2的ORAC值為(1 077.19±60.82),而MSCG-1的ORAC值僅為(56.10±18.49),前者約為后者的19倍.MSCG的ORAC值在MSCG-1和MSCG-2的之間,為(364.93±21.27).MSCG-1與MSCG-2 ORAC值的差異可能主要與其組成及結(jié)構(gòu)的差異有關(guān).

圖8 MSCG、MSCG-1和MSCG-2的ORAC值

根據(jù)前文所述,無論在肽鏈方面還是在糖鏈方面,MSCG-1和MSCG-2的結(jié)構(gòu)都有明顯差異.首先,從氨基酸組成來看,MSCG-2的抗氧化氨基酸含量(199.2 mg/g)明顯高于MSCG-1(80.1 mg/g),這可能是造成MSCG-2抗氧化能力更高的原因之一.其次,MSCG-2的分子質(zhì)量(1.94 ku)也明顯小于MSCG-1(62.0 ku).肽的分子質(zhì)量會影響肽的活性,同樣,多糖分子質(zhì)量也會影響多糖的活性.Liu等[17]研究了不同水解度的乳清蛋白對小鼠的抗疲勞活性,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量低于10 ku的組分具有更高的抗疲勞活性、自由基清除能力以及亞鐵離子螯合能力;Qi等[18]研究了不同分子質(zhì)量的海藻多糖與抗氧化活性的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量的多糖組分具有更高的抗氧化活性;Kao等[19]的研究也表明,一種低分子質(zhì)量的靈芝多糖(3.979 ku)具有較好的抗氧化活性.MSCG-2具有比MSCG-1更低的分子質(zhì)量,這可能也是其抗氧化能力更高的原因之一.最后,MSCG-1與MSCG-2中糖鏈的單糖組成與糖苷鍵連接方式也很不相同.上述因素可能共同導(dǎo)致了二者抗氧化活性的不同.

3 結(jié)論

通過對牛大力糖蛋白分離純化方法、結(jié)構(gòu)組成及抗氧化活性的研究,文中得到以下結(jié)論:

(1)牛大力粗糖蛋白MSCG經(jīng)分離純化,得到分子質(zhì)量約為62.0 ku的MSCG-1和分子質(zhì)量約為1.94 ku的MSCG-2,兩種組分都是比較純的糖蛋白.

(2)MSCG-1和MSCG-2的蛋白含量分別為50.22%和69.37%;MSCG-1中天冬氨酸含量最高,MSCG-2中脯氨酸含量最高;MSCG-2中含有的可能對抗氧化有貢獻(xiàn)的氨基酸總量比MSCG-1中高31.3%.

(3)MSCG-1和MSCG-2的總糖含量分別為38.07%和6.70%;MSCG-1和MSCG-2中均含有鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,MSCG-1中上述7種單糖的摩爾比為1.27 ∶25.55 ∶1.16 ∶1.00 ∶4.12 ∶7.42 ∶21.60,而MSCG-2中為1.84 ∶5.35 ∶1.17 ∶1.00 ∶3.13 ∶48.62 ∶3.00;MSCG-1中的糖鏈由1→4,6連接的半乳糖構(gòu)成主要骨架,大量阿拉伯糖分布在支鏈中,并含有一定比例的→6)-Manp-(1→和→6)-Glcp-(1→;MSCG-2中的糖鏈很有可能是由1→6連接的葡萄糖構(gòu)成主鏈,分支度高,且含有一定的Araf、Manp與Galp結(jié)構(gòu)單元;MSCG-1和MSCG-2中都存在吡喃環(huán),并且都存在β-型糖苷鍵,另外,MSCG-2中還發(fā)現(xiàn)了α-型糖苷鍵.

(4)MSCG-1和MSCG-2中都含有O-糖肽鍵.

(5)MSCG-2的ORAC值顯著高于MSCG-1,前者為1 077.19±60.82,后者僅位56.10±18.49,說明糖蛋白的組成及結(jié)構(gòu)特性對于其抗氧化活性有重要的影響.

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Separation,Identification and Antioxidant Activity of Glycoproteins fromMillettiaSpeciosaChamp.

ZhaoQiang-zhongFengMeng-yingLinLian-zhuZhaoMou-ming

(School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

In order to understand well the structural characteristics,physical and chemical properties and biological activities of glycoprotein fromMillettiaSpeciosaChamp.(MSCG),MSCG was purified by means of ultrafiltration,chromatography Sephadex G-75 and ODS according to its molecular mass distribution,and thus two purified fractions MSCG-1 and MSCG-2 were obtained.Then,the structures of the two fractions were identified by means of HPLC,GC,GC-MS and FT-IR.The results show that (1) the molecular masses of MSCG-1 and MSCG-2 are 62.00 ku and 1.94 ku respectively; (2) MSCG-1 contains 50.22% protein and 38.07% sugar,and it is mainly composed of →4,6)-Galp-(1→ and Araf-(1→;(3) MSCG-2 contains 69.37% protein and 6.70% sugar,and its main chain is composed of →6)-Glcp-(1→ and has a high branch degree; (4) MSCG-1 and MSCG-2 both contain O-link bonds; (5) for the amino acid which may be of antioxidant activities,its content in MSCG-2 is 31.3% higher than that in MSCG-1; (6) the oxygen radical absorbance capacities (ORAC) of MSCG-1 and MSCG-2 are (56.10±18.49) and (1 077.19±60.82) μmol/g; and (7) the antioxidant activity of MSCG-2 is significantly higher than those of MSCG and MSCG-1,which means that the molecular composition,molecular mass and structural characteristics of glycoprotein determine their antioxidant activities.Key words:MillettiaSpeciosaChamp.;glycoprotein;separation;purification;structure identification;antioxidants

2015- 04- 10

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2012B090600025) Foundation item: Supported by the Production,Education and Research Cooperative Project of Guangdong Province and the Ministry of Education(2012B090600025)

趙強(qiáng)忠(1976-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事食品生物技術(shù)研究.E-mail: qzzhao@scut.edu.cn

? 通信作者： 趙謀明(1964-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事食品生物技術(shù)研究.E-mail: femmzhao@scut.edu.cn

1000- 565X(2015)11- 0008- 08

Q 513+.2

10.3969/j.issn.1000-565X.2015.11.002