雍 康，張傳師，楊慶穩(wěn)，母治平，彭津津

(重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技系,重慶 萬州 404155)

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專題論述

增殖乳腺干細胞
——提高奶牛產(chǎn)奶量的新策略*

雍 康，張傳師，楊慶穩(wěn)，母治平，彭津津

(重慶三峽職業(yè)學(xué)院動物科技系,重慶 萬州 404155)

選育高產(chǎn)品種、提供優(yōu)質(zhì)日糧和注射催乳激素等是目前提高奶牛泌乳量的常用方法。增殖乳腺干細胞是一種增加奶牛產(chǎn)奶量的新思路，目前應(yīng)用報道很少。增殖乳腺干細胞可以減少和挽回因較長的干奶期和乳腺炎等因素造成的產(chǎn)奶量降低所引發(fā)的經(jīng)濟損失，具有良好的應(yīng)用前景。本文綜述了奶牛乳腺干細胞的生物學(xué)特征、在乳腺發(fā)育中的作用以及增殖方法等，旨在為提高奶牛泌乳量提供一種新思路。

乳腺干細胞；增殖；產(chǎn)奶量；奶牛

奶牛產(chǎn)奶量受乳腺上皮細胞數(shù)目和每個細胞分泌活性的影響。乳腺上皮細胞的分化狀態(tài)決定其分泌活性。低分化的乳腺上皮細胞通常不分泌乳汁，而中間和完全分化的細胞可以分泌[1]。雖然激素，如雌激素、孕激素和催乳素影響這些細胞的分化，但其再生取決于乳腺干細胞(Mammary stem cells，MaSCs)的活性[2]。MaSCs屬于多能成體干細胞，具有自我更新和分化為其他類型細胞的能力。不同發(fā)育時期的動物乳腺中都存在一定比例的干細胞，其主要作用是增殖，以保證乳腺的正常發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)[3]。研究表明，利用干細胞抗原從小鼠乳腺中分離得到的MaSCs具有乳腺分化潛能，體外誘導(dǎo)可以分化為乳腺組織的各種類型細胞，在體內(nèi)，單個MaSCs可以發(fā)育成一個功能良好的乳腺[4]。

1 MaSCs的生物學(xué)特征

MaSCs是存在于發(fā)育成熟乳腺組織中的具有高度自我更新和增殖潛能的未分化細胞，可以產(chǎn)生各級祖細胞，并最終分化形成肌上皮細胞和腺上皮細胞[5]。它們通過對稱性有絲分裂(形成兩個相同的干細胞)和不對稱性分裂(一個子細胞最終分化為功能細胞，另一個分裂成為干細胞保留下來)保持未分化干細胞的存在。在增殖過程中干細胞對稱分裂，當維持組織穩(wěn)態(tài)時，它們不對稱分裂。雖然，成體干細胞具有無限增殖的能力，但原位分裂不頻繁。干細胞的后代——祖細胞，增殖能力不及干細胞，但分裂頻繁。譜系限制性祖細胞具有很強的增殖能力，并產(chǎn)生分化細胞，以確保導(dǎo)管生長、腺泡發(fā)育，并最終產(chǎn)生乳汁[6]。目前，鑒定乳腺干細胞標記物有干細胞抗原1(Sca-1)、CK5/6、CK19、Musashi、α6整合素(即CD49f)，β1整合素(CD29)、OCT4，SOX2和NANOG等。這些標記物不具特異性，不能單獨用這些標記物來區(qū)分干細胞與分化細胞，必須綜合利用[7]。

2 MaSCs在奶牛乳腺發(fā)育中的作用

MaSCs及其增殖在牛妊娠、泌乳和泌乳衰退周期中乳腺正常生長、分化和再生具有重要作用[8]。MaSCs可以分化為各級祖細胞和終末細胞(腺上皮細胞和肌上皮細胞)。腺上皮細胞和肌上皮細胞分別發(fā)育成乳腺的腺泡和導(dǎo)管，完成乳汁的生成和排泄。腺泡和導(dǎo)管是構(gòu)成乳腺實質(zhì)的主要部分，乳腺結(jié)構(gòu)常處于變化過程中，其基本特征與動物年齡、懷孕、哺乳有直接關(guān)系。犢牛出生后乳腺未發(fā)育，到初情期時， MaSCs活性增加，引起導(dǎo)管生長[9-10]，形成分支復(fù)雜的細小導(dǎo)管系統(tǒng)，乳房體積開始膨大。在以后的發(fā)情周期中，繼續(xù)發(fā)育。牛妊娠后，乳腺組織生長比較迅速，乳腺導(dǎo)管數(shù)量繼續(xù)增加，并且在每個導(dǎo)管末端開始形成沒有分泌腔的腺泡；在妊娠中期，腺泡逐漸出現(xiàn)分泌腔，腺泡和導(dǎo)管體積不斷增大，妊娠后期腺泡的分泌上皮(乳腺上皮細胞)開始具有分泌功能。分娩前，腺泡分泌初乳；分娩后，乳腺開始正常泌乳。經(jīng)過一段時間的泌乳活動后，MaSCs活性降低[11]，乳腺開始漸進性回縮，腺泡體積重新縮小，分泌腔逐漸消失，細小乳導(dǎo)管重新萎縮，最終導(dǎo)致泌乳停止，進入干奶期(通常為50～60 d)。在干奶期內(nèi)，乳腺組織能最大限度的重新形成。奶牛一般在第6～8個泌乳期中，乳腺的發(fā)育達到最大程度，泌乳量也達到最高峰。以后隨年齡增大，泌乳量逐年降低。乳腺生長發(fā)育呈現(xiàn)明顯的周期性變化，這些變化與性周期中卵巢所分泌激素(主要是雌激素和孕激素)調(diào)節(jié)有關(guān)[6]。

3 MaSCs的擴增方法

Capuco等[9]提出MaSCs擴增可以增加細胞更新、增強組織再生和乳腺上皮細胞的分泌活性。內(nèi)源性(包括雌激素、孕激素和生長激素)和外源性(包括牛生長激素，黃苷和肌苷)物質(zhì)能擴增MaSC和乳腺上皮細胞數(shù)目[6]。

3.1 使用黃嘌呤核苷和肌苷

黃苷和肌苷是嘌呤核苷，充當從頭合成鳥嘌呤核苷酸的前體。Sherley等[12]證實了p53介導(dǎo)大鼠肝干細胞和毛囊干細胞的不對稱分裂。這個過程是在鳥嘌呤核苷酸合成中的限速酶肌苷5'-單磷酸脫氫酶(IMPDH)的下調(diào)介導(dǎo)的。黃苷或次黃苷進入機體繞過了IMPDH介導(dǎo)的步驟，從而增加細胞中鳥嘌呤濃度，進而促進干細胞的對稱分裂和擴增[13]。黃苷已被成功地用于提高母牛數(shù)量[14]。Choudhary等[15]進一步研究證明，在泌乳牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)物中，黃苷提高了乳腺上皮細胞的增殖能力并增加了干細胞數(shù)量。誘發(fā)黃嘌呤轉(zhuǎn)錄變化的細節(jié)和黃嘌呤如何改變細胞增殖的分子機制，有待進一步研究。

3.2 使用生長激素和雌激素

在發(fā)育期，雌激素和生長激素會引起乳腺樹中的導(dǎo)管增長。因此，雌激素和生長激素可能會使導(dǎo)管中MaSCs的增殖。Dou等[16]通過微球體的增長證實，培養(yǎng)基中有雌激素和生長激素存在時，Sca-1POS細胞增殖的數(shù)量較大，這表明，雌激素和生長激素促進了MaSCs的增殖。

3.3 使用黃體酮和孕激素

一項研究表明天然孕酮觸發(fā)小鼠MaSCs (CD24posCD49fhigh)的擴增[17]，這與孕激素會增加乳房中DNA復(fù)制和祖細胞數(shù)量的研究結(jié)論一致。在乳腺中，孕激素以旁分泌的方式作用于MaSCs[18]。牛乳腺組織的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，孕酮受體(Progesterone receptor，PR)在小母牛和哺乳期的牛乳腺上皮細胞、基質(zhì)和內(nèi)皮細胞的核內(nèi)表達[19]?；讓拥娜橄偕掀ぜ毎?，通常缺乏PR表達[19]。WNT4和RANKL通路介導(dǎo)孕激素的有絲分裂[17]。管腔細胞內(nèi)RANK和基底細胞內(nèi)RANKL(RANKL的受體)的增量表達，是基底的MaSCs內(nèi)孕激素可能的效應(yīng)。孕激素與雌激素聯(lián)合使用比單獨使用雌激素引起乳腺中更高的細胞增殖[20]。

3.4 使用黃嘌呤，次黃嘌呤

黃苷已被證明能增加乳腺上皮細胞的增殖[14]。上皮細胞分泌活性的增強會增加奶牛泌乳早期到哺乳期峰值的奶產(chǎn)量。然而，這一時期奶產(chǎn)量下降的主要原因是由于未孕牛細胞凋亡增加引起上皮細胞數(shù)量減少造成的[6]，雖然每個細胞分泌活性沒有顯著改變。黃苷能使泌乳后期細胞凋亡率減弱，這將有可能導(dǎo)致分泌細胞可用性增加，從而延長了泌乳時間。

肌苷，類似于黃苷的化合物，已經(jīng)成功地用于增加轉(zhuǎn)基因山羊奶產(chǎn)量[21]。轉(zhuǎn)基因山羊由于細胞凋亡較快，是差的奶生產(chǎn)者[22]，泌乳早期乳房內(nèi)使用肌苷已被證明能增加從第1 d到哺乳高峰期(50 d)奶產(chǎn)量。使用肌苷刺激MaSCs可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因山羊細胞增殖的級聯(lián)反應(yīng)和防止哺乳提前結(jié)束。顯然，該研究表明肌苷有增加轉(zhuǎn)基因山羊MaSC數(shù)量的作用。在干細胞內(nèi)鳥嘌呤核苷酸的濃度增加有利于細胞的對稱有絲分裂[13]。研究證實黃苷能增加小母牛MaSCs和祖細胞數(shù)量[14]。此外，肌苷對山羊和奶牛使用的劑量，次數(shù)需要進行評估。

3.5 使用中草藥

王蕾等[23]通過MTT比色法分析不同劑量黃芪和丹參對體外分離培養(yǎng)的人乳腺成體干細胞增殖影響時發(fā)現(xiàn)，丹參和小劑量黃芪均可提高體外分離培養(yǎng)的MaSCs增殖能力，且兩藥低劑量聯(lián)合使用促增殖作用更為明顯。秦君等[24]用王不留行的3類主要成分(皂甙類、黃酮甙類及香豆素類)對體外培養(yǎng)小鼠乳腺上皮細胞增殖的作用進行了檢測。結(jié)果顯示，只有王不留行黃酮甙類成分具有促進泌乳的作用。這項研究為中藥催乳針劑的研發(fā)提供了理論依據(jù)。目前，中草藥是如何提高哺乳動物泌乳量的機制尚不確定，此外，其他促乳中草藥，如穿山甲、通草能否提高MaSCs的增殖能力未見報道，需要進一步研究證實。

4 加快乳腺上皮細胞更新，縮短干奶期

干奶期對乳腺上皮細胞再生非常重要。在這個時期，新上皮細胞取代喪失產(chǎn)奶能力的衰老細胞，為下一個哺乳期做準備。如果能在干奶期提高MaSCs的活性，加快細胞更新，那么干奶期越短，牛泌乳總量越多。因此，縮短干奶期是增加泌乳效率的另一種方法。Annen等[25]研究表明，在牛生長激素作用下，縮短干奶期(30 d)或省略干奶期，在下一泌乳中沒有改變經(jīng)產(chǎn)奶牛的奶產(chǎn)量[25]。對哺乳期荷斯坦奶牛使用牛生長激素后，增殖標志物Ki-67的表達比對照組增加了3倍，這就證明牛生長激素提高了乳腺上皮細胞的更新能力[26]。換句話說，對于乳腺上皮細胞可再生的奶牛，60 d 的干奶期縮短到30d沒有對下一哺乳期產(chǎn)奶量產(chǎn)生有害影響。

5 展 望

提高泌乳動物的產(chǎn)奶量一直是乳腺干細胞生物學(xué)家的最終目標。通過激素(如孕酮、雌激素、生長激素、黃苷或肌苷)療法增殖MaSCs，可能會增加細胞更新或哺乳期的持續(xù)性，進而提高奶牛泌乳量。進一步研究MaSCs的生物學(xué)特性以及它們在乳腺形成、組織轉(zhuǎn)化和平衡中的作用很有必要。此外在奶牛不同的泌乳階段，MaSCs發(fā)揮的作用有何不同，如何在不同的泌乳階段采用不同的策略(使用激素、藥物等措施)調(diào)動和調(diào)節(jié)MaSCs的活性，使之達到效益(泌乳量)最大化，是未來的主要研究方向。

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Role of Mammary Stem Cells Proliferation in Milk Yield Boosting

YONG Kang ,ZHANG Chuan-shi,YANG Qing-wen, MU Zhi-ping, PENG Jing-jing

(DepartmentofAnimalScienceandTechnology,ChongqingThreeGorgesVocationalCollegeWanzhou,Chongqing404155,China)

High-yielding varieties breeding, optimum diet supply and prolactin hormones injection are conventionally approaches to boost milk yield. Proliferation of breast stem cells, a new strategy to increase yield, can dramatically reduce the amount of milk loss or decline due to a long dry period and mastitis. Cows biological characteristics of mammary stem cells,its role in mammary gland development and proliferation methods were reviewed in the paper to provide a new strategy to increase milk yield.

breast stem cells; proliferation; milk; cows

2014-10-11，

2014-11-19 [基金項目] 重慶市高等職業(yè)技術(shù)院校應(yīng)用技術(shù)推廣中心新技術(shù)推廣項目(TG1310001)

雍 康(1984-)，男，陜西洋縣人，講師，碩士，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)教學(xué)和研究。 E-mail:yongkangkang@126.com

S811.6

A

1005-5228(2015)03-0083-03