甘 蕾，李 真，吳曉華，應(yīng)德美，陳莉萍 (第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶400037)

黃體和胎盤組織分泌的孕激素(progesterone，P)對(duì)維持妊娠有至關(guān)重要的作用，在對(duì)孕激素與代謝相關(guān)性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，孕激素可引起糖耐量降低，增加胰島素抵抗(insulin resistance，IR)［1］，還可調(diào)控脂蛋白脂酶活性，促進(jìn)脂質(zhì)合成［2］，引起糖脂代謝失衡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)妊娠期糖耐量異常的患者血瘦素(leptin，LEP)濃度變化與孕激素水平相關(guān)［3］。孕激素水平增高，可否引起瘦素功能異常，參與妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)發(fā)生，尚待探討。孕期胎盤組織可合成瘦素［4］，瘦素的生物功能除了與瘦素濃度的相關(guān)外還與瘦素受體密切相關(guān)，其中可溶性的瘦素受體(soulbe leptin receptor，SLR)被認(rèn)為是瘦素敏感性的標(biāo)志［5］。SLR 參與體內(nèi)瘦素的運(yùn)輸、調(diào)控瘦素的濃度，影響瘦素的生物活性［6］。而對(duì)SLR 的研究，并未發(fā)現(xiàn)編碼SLR 生成的基因片段［5］，有學(xué)者提出SLR 可能是基質(zhì)金屬蛋白酶10 (a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10)介導(dǎo)長(zhǎng)型瘦素受體(leptin receptor，Ob-R)胞外區(qū)脫落產(chǎn)生［5］?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)早孕人絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，探討不同濃度孕激素對(duì)人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的ADAM10、Ob-R及分泌SLR、LEP 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

絨毛組織采集于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院婦產(chǎn)科門診，正常妊娠6 ～10 周，經(jīng)超聲證實(shí)為宮內(nèi)妊娠，自愿選擇人工流產(chǎn)終止妊娠的健康婦女，經(jīng)負(fù)壓吸宮術(shù)獲得的絨毛組織。將其置于預(yù)冷的含有雙抗的無菌DMEM-F12 培養(yǎng)基內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中分離培養(yǎng)細(xì)胞。本研究遵循第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 人早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

用DMEM-F12 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗絨毛組織，去除血污、蛻膜及肉眼可見的血管組織，用眼科剪剪碎為1 mm ×1 mm 左右大小的碎屑。加入適量的0.25% 的胰蛋白酶在常溫下消化20 min，其間進(jìn)行適當(dāng)?shù)卮荡?，任其自然沉淀，?∶1 的體積加入含有20%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基中和胰酶作用，吸出上清液，未消化組織重復(fù)消化2 次，將吸取的上清液經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過，吸取濾過液于離心管中，以800 r/min ×5 min 離心，倒掉上清液，加入含有20%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基，反復(fù)吹打，吸入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后，換掉一半的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，換液，以后每隔48 h 換液1 次。

1.3 人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞鑒定

培養(yǎng)的第一代細(xì)胞，采用S-P 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗－細(xì)胞角蛋白7 抗體和抗－細(xì)胞波形蛋白抗體，進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞鑒定。

1.4 不同濃度孕激素培養(yǎng)人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞

采用胰蛋白酶消化后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的滋養(yǎng)層細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)、按每孔1 ×106/mL 接種于12 孔板中。使用無血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，觀察細(xì)胞貼壁情況，吸掉培養(yǎng)基，分為4 組，分別加入含有0、100、150、200 ng/mL 孕激素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞及上清液。

1.5 WB 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADAM10、Ob-R 的表達(dá)

采用PMSF/RIPA 裂解液說明書上的步驟提取蛋白，用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白含量，計(jì)算上樣量，取蛋白樣品50 μg 進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗，4 ℃冰箱隔夜孵育，TBST 洗膜，孵育二抗，洗膜，ECL 發(fā)光液反應(yīng)，曝光。凝膠成像系統(tǒng)掃描儀成像。用Image J 軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 ELISA 法檢測(cè)上清液中SLR、LEP 的表達(dá)量

根據(jù)ELISA 試劑盒上的相關(guān)操作說明，檢測(cè)細(xì)胞上清液中SLR 及LEP 的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析比較各物質(zhì)組間差異性，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Pearson 檢驗(yàn)各物質(zhì)間的相關(guān)性。P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 胰蛋白酶消化法培養(yǎng)人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞

倒置顯微鏡下見細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)，細(xì)胞體積大呈長(zhǎng)多邊形，胞漿豐富，核呈卵圓形，個(gè)別細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣，生長(zhǎng)成片(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞(×200)

2.2 免疫組化法鑒定人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞

DAB 顯色后的陽性信號(hào)為胞漿中呈棕黃色顆粒，胎盤組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的角蛋白染色陽性，著色于胞漿(圖2a)，波形蛋白染色陰性(圖2b)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞中細(xì)胞角蛋白陽性率約90%。

圖2 免疫組化法鑒定人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞

2.3 孕激素影響細(xì)胞內(nèi)ADAM10 和Ob-R 的表達(dá)

人胎盤絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)ADAM10 的含量隨著與激素濃度的增加而增加(P ＜0.05)。孕激素對(duì)Ob-R 隨著孕激素濃度的增高組間兩兩比較無顯著性差異(P ＞0.05)，但仍可看出隨著孕激素濃度的增高，Ob-R 的表達(dá)有逐漸上升趨勢(shì)(圖3，表1)。

圖3 WB 法檢測(cè)不同濃度孕激素對(duì)ADAM10 及Ob-R 的影響

2.4 孕激素影響細(xì)胞對(duì)SLR、LEP 的分泌

胎盤組織合成和分泌的SLR 隨著孕激素濃度增加而逐漸減少(P ＜0.01)，而LEP 含量隨著孕激素濃度的增加而增加(P ＜0.01)，見表2。

表1 不同濃度孕激素對(duì)胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)ADAM10、Ob-R 的影響(±s)

表1 不同濃度孕激素對(duì)胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)ADAM10、Ob-R 的影響(±s)

* :與對(duì)空白組(0 ng/mL)比較，P ＜0.05;#:與對(duì)空白組(0 ng/mL)比較，P ＜0.01

?

表2 不同濃度孕激素對(duì)胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌SLR 及LEP 的影響(±s)

表2 不同濃度孕激素對(duì)胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌SLR 及LEP 的影響(±s)

* :與對(duì)空白組(0 ng/mL)比較，P ＜0.01

?

2.5 Pearson 檢驗(yàn)各因素之間相關(guān)性結(jié)果

采用SPSS 19.0 軟件分析比較人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的各物質(zhì)之間的相關(guān)性。SLR 的表達(dá)與LEP 的表達(dá)存在顯著性負(fù)相關(guān)(R= －0.949，P ＜0.01)，ADAM10 與Ob-R 的表達(dá)不存在明顯相關(guān)性(R= －0.425，P ＞0.05)。

3 討論

3.1 孕激素與GDM 發(fā)生的相關(guān)性

妊娠期糖尿病是指妊娠期首次發(fā)生或者發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖耐量異常，其病理特征是高胰島素血癥、高瘦素血癥所伴隨的糖脂代謝紊亂。國內(nèi)外對(duì)孕激素與妊娠期糖尿病的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖耐量異常的患者血孕激素水平顯著高于正常妊娠產(chǎn)婦［3，7］。而關(guān)于口服避孕藥與GDM 相關(guān)性的研究，發(fā)現(xiàn)孕齡期女性孕前使用口服避孕藥GDM 發(fā)生率增高［8］，有GDM 史女性服用孕激素類避孕藥產(chǎn)后5 ～10 年發(fā)生2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)約為20% ～60%［9］。此外，關(guān)于孕激素治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)人群，研究發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致糖耐量降低和GDM 的發(fā)生率增加［8，10］。

孕激素參與GDM 發(fā)生主要是通過影響糖脂代謝所致。孕激素可導(dǎo)致空腹血糖升高及胰島素抵抗。Yeung 等［11］發(fā)現(xiàn)人黃體期胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模式(HOMA-IR)與血清孕激素水平增加相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，外源性地給予大鼠孕激素可導(dǎo)致胰島素敏感性下降而血糖增高［12-13］，此外，Sissan 等［14］研究發(fā)現(xiàn)孕激素可通過抑制肝臟蘋果酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，導(dǎo)致葡萄糖利用障礙，血糖升高。而關(guān)于孕激素影響脂代謝主要表現(xiàn)為影響脂蛋白酯酶的活性［1］。Sissan 等［14］研究還發(fā)現(xiàn)孕激素可增加脂肪組織脂蛋白酯酶的活性，使脂肪組織分解增加，血脂升高。

3.2 孕激素調(diào)控瘦素功能發(fā)揮影響GDM 發(fā)病

GDM 的發(fā)病通常在孕激素水平很高的妊娠中期［15］，說明孕激素在GDM 發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中起著某種作用。而目前臨床上對(duì)于孕激素參與糖脂代謝異常的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，早期研究發(fā)現(xiàn)孕激素對(duì)胰島素的分泌及信號(hào)傳導(dǎo)有重要作用［8］。近年來隨著對(duì)瘦素的深入研究發(fā)現(xiàn)，瘦素與胰島素存在著復(fù)雜的關(guān)系，他們共同參與調(diào)節(jié)糖脂代謝，與妊娠期糖尿病、肥胖、2 型糖尿病等代謝綜合征密切相關(guān)。女性妊娠狀態(tài)下血瘦素濃度約為非孕時(shí)期的2 ～3 倍，且在孕28 周達(dá)到高峰［16］。在對(duì)瘦素與GDM 相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，血清瘦素每增加10 ng/mL，GDM 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)增加20%［17］。

妊娠期瘦素的合成和分泌受到胎盤組織合成和分泌的多種激素(如人絨毛膜促性腺激素、胎盤泌乳素、雌激素、孕激素等)的影響，關(guān)于孕激素與瘦素之間的相關(guān)性存在許多矛盾性研究［3，18-20］。目前臨床研究上暫無文獻(xiàn)表明孕激素可通過某種具體的路徑影響瘦素分泌參與GDM 發(fā)生，而瘦素功能的發(fā)揮不僅僅受到瘦素濃度的影響還受到瘦素受體的影響。孕激素是通過調(diào)控瘦素的分泌還是通過調(diào)控瘦素受體表達(dá)參與GDM 發(fā)生，尚不清楚。

瘦素與瘦素受體結(jié)合參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，瘦素受體的表達(dá)是維持正常妊娠所必需的［21］。瘦素受體屬于I 類細(xì)胞因子受體家族，其中重要的瘦素受體包括長(zhǎng)型受體(Ob-R)-參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和SLR-調(diào)控瘦素濃度及瘦素生物活性。人的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)瘦素及瘦素受體［22］。從瘦素受體表達(dá)來看，GDM 孕婦胎盤上的瘦素受體表達(dá)高于正常妊娠孕婦［17］。而對(duì)瘦素基因的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素受體Gln223Arg 與胰島素抵抗、高瘦素血癥及肥胖密切相關(guān)［23-25］。瘦素受體的表達(dá)與GDM 發(fā)生相關(guān)，而孕激素可否通過某種路徑作用于瘦素受體，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。我們的研究發(fā)現(xiàn)孕激素影響早孕人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞ADAM10的表達(dá)及SLR、LEP 分泌，而對(duì)Ob-R 的表達(dá)無顯著影響。

關(guān)于SLR 的研究，并未發(fā)現(xiàn)編碼SLR 合成的特異mRNA，有學(xué)者認(rèn)為SLR 可由金屬蛋白酶參與長(zhǎng)型瘦素受體(Ob-R)脫落的產(chǎn)生［26］。Schaab 等［5］發(fā)現(xiàn)ADAM10 參與了SLR 的產(chǎn)生。國外學(xué)者在對(duì)SLR 與一系列代謝性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，SLR 與肥胖、IR、2 型DM及其他代謝相關(guān)危險(xiǎn)因子(血壓、甘油三酯濃度、低密度脂蛋白濃度、空腹血糖濃度)呈顯著的負(fù)相關(guān)，SLR與高密度脂蛋白(HDL)呈正相關(guān)，SLR 被認(rèn)為可以預(yù)測(cè)糖尿病及代謝綜合征發(fā)生的因子［5］。基于此，本實(shí)驗(yàn)探討孕激素與人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的ADAM10、Ob-R 及上清液中LEP 及SLR 表達(dá)的相關(guān)性，尋求可能存在的GDM 發(fā)病機(jī)制。我們研究發(fā)現(xiàn)SLR 的表達(dá)與LEP 的表達(dá)存在顯著性負(fù)相關(guān)(R= －0.949，P=0.000)，ADAM10 與Ob-R 的表達(dá)無明顯相關(guān)性(R = －0.425，P ＞0.05)。因此，本課題組認(rèn)為孕激素增高可通某種路徑，調(diào)控ADAM10 的表達(dá)，影響SLR 的生成，引起瘦素功能發(fā)揮異常，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，參與GDM 發(fā)生。而關(guān)于孕激素通過何種路徑影響ADAM10，是本課題組下一步將探討的問題。

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