高 麗，卞 卡 (1.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅，陜西 西安710038;.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻咽喉科，陜西 西安710038)

下咽癌又稱為喉咽癌，是原發(fā)于舌根、會(huì)厭、梨狀窩、杓會(huì)厭皺襞、環(huán)狀軟骨后區(qū)、喉咽側(cè)壁及后壁等區(qū)域的一種病因不明的惡性腫瘤。下咽癌發(fā)病率不高，占全身惡性腫瘤的0.5%，但5 年生存率僅有25% ～40%［1-2］。目前治療方式以手術(shù)為主，輔以圍手術(shù)期的放化療等綜合治療。導(dǎo)致生存率不高的主要原因是下咽癌易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，半數(shù)以上的患者早期即出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此弄清楚下咽癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生原理及影響轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于深入了解下咽癌，改善其治療效果、提高患者生存率有非常重要的臨床意義。MicroRNA 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為22 個(gè)核苷酸左右的非編碼單鏈RNA 分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。我們已經(jīng)通過研究證明，MicroRNA-203 在一些腫瘤中可以發(fā)揮抑癌微小RNA 的作用［3］，但其在下咽癌中的作用尤其是對(duì)下咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究了MicroRNA-203 通過調(diào)控靶基因MEKK1 在下咽癌的轉(zhuǎn)移中起的作用，對(duì)于進(jìn)一步闡明MicroRNA-203 對(duì)下咽癌的生物學(xué)活性的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人下咽癌細(xì)胞系Fadu 由美國Baylor 醫(yī)學(xué)院Weiwen Long副教授饋贈(zèng)。pcDNA3-MEKK1 質(zhì)粒、由美國Baylor 醫(yī)學(xué)院Weiwen Long 教授饋贈(zèng)。相關(guān)試劑載體:MEKK1 兔源多克隆抗體(美國Enzo Life Sciences 公司)，β-actin 鼠源單克隆抗體(美國Sigma 公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen 公司)。克隆質(zhì)粒pMD-18T(日本Takara 公司);慢病毒系統(tǒng)pLenti-6.3(美國Invitrogen 公司)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因質(zhì)粒(美國Promega 公司)。主要儀器設(shè)備:Western blot 系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)，RT-PCR 檢測儀(美國ABI 公司)。

1.2 方法

1.2.1 過表達(dá)MicroRNA-203 的慢病毒包裝 構(gòu)建含有目的基因pre-MicroRNA-203 的慢病毒載體，純化提取質(zhì)粒，將慢病毒載體與包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T，培養(yǎng)48 ～72 h后收集含有病毒的上清培養(yǎng)液得到慢病毒Lv-MicroRNA-203與Lv-luc，將病毒純化和濃縮后得到的病毒上清檢測滴度，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 qRT-PCR 檢測慢病毒Lv-Luc 及Lv-MicroRNA-203 轉(zhuǎn)染Fadu 細(xì)胞后MicroRNA-203 的表達(dá) 用慢病毒Lv-luc 與Lv-MicroRNA-203 分別轉(zhuǎn)染下咽癌細(xì)胞Fadu，用Trizol 法分別提取Fadu-Lv-Luc 和Fadu-Lv-MicroRNA-203 兩種細(xì)胞的RNA，利用Reverse Transcription Kit(Invitrogen 公司)進(jìn)行MicroRNA-203 的逆轉(zhuǎn)錄，得到的產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力檢測實(shí)驗(yàn) 饑餓細(xì)胞12 ～24 h 后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5 ×105/mL。取細(xì)胞懸液100 μl 加入Transwell 小室，24 孔板下室加入600 μl 含血清的培養(yǎng)基。注意下層培養(yǎng)基和小室間不要產(chǎn)生氣泡。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞18 h，取出Transwell 小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS 洗2 遍，甲醇固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS 洗3 遍。顯微鏡下隨機(jī)5 個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。

1.2.4 利用生物信息學(xué)方法預(yù)測MicroRNA-203 下游調(diào)控靶分子 在喉癌細(xì)胞中利用生物信息學(xué)分析軟件TargetScan、MiRanda 和PicTar 分析MicroRNA-203 可能的下游靶基因，預(yù)測miRNA 種子區(qū)的結(jié)合;根據(jù)得出的分值高低，預(yù)測出相關(guān)下游靶基因，將靶基因的3’UTR 與MicroRNA-203 種子區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證MicroRNA-203 的靶基因構(gòu)建雙熒光素酶表達(dá)載體，將希望鑒定的MicroRNA-203 靶基因的MEKK1 的3’UTR 插入熒光素酶基因的3’UTR 中，得到pGL3-WT-MEKK1-UTR/pGL3-mut-MEKK1-UTR 及對(duì)照載體pRL-TK。將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)染Fadu-Lv-MicroRNA-203 細(xì)胞與陰性對(duì)照Fadu-Lv-Luc 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后檢測細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)情況。檢測方法參照Dual-Glo Luciferase Assay System說明書。計(jì)算分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果以P ＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR 檢測穩(wěn)定感染Lv-Luc 及Lv-MicroRNA-的Fadu 細(xì)胞中MicroRNA-203 的表達(dá)

用慢病毒Lv-luc 與Lv-MicroRNA-203 分別轉(zhuǎn)染下咽癌細(xì)胞Fadu，得到Fadu-Lv-Luc 與Fadu-Lv-MicroRNA-203。qRT-PCR結(jié)果顯示與陰性對(duì)照Fadu-Lv-Luc 細(xì)胞相比，F(xiàn)adu-Lv-MicroRNA-203 細(xì)胞的MicroRNA-203 的表達(dá)量提高了約390 倍(P ＜0.01)。說明利用慢病毒Lv-MicroRNA-203 感染Fadu 細(xì)胞得到了穩(wěn)定高表達(dá)MicroRNA-203 的下咽癌細(xì)胞株(圖1)。

圖1 qRT-PCR 檢測慢病毒感染的Fadu 細(xì)胞MicroRNA-203表達(dá)量

2.2 MicroRNA-203 對(duì)下咽癌細(xì)胞遷移能力的調(diào)控

Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示，在過表達(dá)MicroRNA-203 的下咽癌細(xì)胞Fadu-Lv-MicroRNA-203 中，穿過Transwell 膜的細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于對(duì)照Fadu-Lv-Luc(P ＜0.05)，說明在下咽癌細(xì)胞中高表達(dá)MicroRNA-203 可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的遷移能力(圖2)。

圖2 transwell 實(shí)驗(yàn)檢測下咽癌細(xì)胞的遷移

2.3 MEKK1 是MicroRNA-203 的下游負(fù)向調(diào)控分子

使用miRanda、TargetScan、PicTar 3 種微小RNA 靶基因預(yù)測軟件，通過分析得出MicroRNA-203 的潛在可能靶基因MEKK1。結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫，將MicroRNA-203 與MEKK1 的3’UTR 區(qū)進(jìn)行同源互補(bǔ)分析，圖3 所示兩者有明顯的種子區(qū)互補(bǔ)的假想位點(diǎn)，說明MEKK1 有可能是MicroRNA-203 的下游靶基因之一，同時(shí)在報(bào)告基因中對(duì)MEKK1 成功進(jìn)行了單點(diǎn)突變的載體構(gòu)建。

圖3 MicroRNA-203 序列與MEKK1 3’UTR 序列相關(guān)性分析

2.4 下咽癌細(xì)胞高表達(dá)MicroRNA-203 后MEKK1 蛋白表達(dá)的變化

Western blot 與qRT-PCR 結(jié)果顯示，在下咽癌細(xì)胞中高表達(dá)MicroRNA-203 后MEKK1 的蛋白表達(dá)水平(圖4)及mRNA表達(dá)水平(圖5)均有顯著下降(P ＜0.05)，提示MicroRNA-203可通過結(jié)合MEKK1 3’UTR 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用，通過加速降解MEKK1 mRNA 來降低MEKK1 蛋白的表達(dá)。

圖4 Western blot 檢測過表達(dá)MicroRNA-203 的下咽癌細(xì)胞中MEKK1 的蛋白表達(dá)

圖5 qRT-PCR 檢測過表達(dá)MicroRNA-203 的下咽癌細(xì)胞中MEKK1 的mRNA 表達(dá)量

2.5 雙熒光素酶檢測MicroRNA-203 對(duì)MEKK1 有抑制作用

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在下咽癌細(xì)胞Fadu 中轉(zhuǎn)染MEKK1 螢光素酶表達(dá)載體后，在高表達(dá)MicroRNA-203 的Fadu 細(xì)胞中，MEKK1 的熒光素酶活性大大降低，是正常下咽癌細(xì)胞的65%(圖6)。但我們將MEKK1 進(jìn)行突變后，MicroRNA-203 的表達(dá)對(duì)MEKK1 的熒光素酶活性則無影響。提示MEKK1 可能是MicroRNA-203 的一個(gè)下游調(diào)控靶分子，MicroRNA-203 與MEKK1 的3’UTR 結(jié)合后對(duì)它進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測MicroRNA-203 對(duì)MEKK1 的作用

3 討論

近年來，伴隨對(duì)人類基因組結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步深入探析，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中存在一類長度約為19 ～25 nt 的小核酸類物質(zhì)微小RNA(microRNA，miRNA)，它可以通過結(jié)合與自身序列部分堿基互補(bǔ)匹配的mRNA 分子，通過抑制其翻譯或降解mRNA 自身達(dá)到轉(zhuǎn)錄后基因沉默的調(diào)節(jié)功能，已知的MicroRNA 已經(jīng)超過千種［4］。眾多研究［5-14］表明MicroRNA 與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以MicroRNA-203 為例，研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-203 在宮頸癌等許多惡性腫瘤中高表達(dá)，表現(xiàn)出癌基因的作用［5-6］，然而在肝癌等另一部分腫瘤中，MicroRNA-203 又被發(fā)現(xiàn)起到抑癌基因的作用［7-14］。因此，MicroRNA-203 在不同類型的腫瘤中起到怎樣的作用，需要更加深入地研究。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)MicroRNA-203 明顯抑制了頭頸腫瘤細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞周期進(jìn)展速率［3］，其通過結(jié)合survivin 3’UTR 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因沉默的作用，抑制survivin 在頭頸腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而影響對(duì)細(xì)胞存活及增殖的生物學(xué)效應(yīng)。由此我們相信，MicroRNA-203 在頭頸腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中很可能是一個(gè)重要的功能分子和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了MicroRNA-203 對(duì)下咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，證明MEKK1 為MicroRNA-203 的有效下游靶基因，有可能通過MicroRNA-203 對(duì)其的抑制發(fā)揮著調(diào)控下咽癌轉(zhuǎn)移能力的作用。MEKK1 是MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的結(jié)點(diǎn)位置，其生物學(xué)作用與腫瘤的增殖、遷移、運(yùn)動(dòng)、侵襲等密切相關(guān)［15］。雖然MEKK1 在腫瘤的生物學(xué)活動(dòng)中起到十分重要的作用，但目前還沒有有效的MEKK1 抑制劑上市，因此深入研究MEKK1 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的的作用機(jī)制，尋找MicroRNA-203 等直接作用于MEKK1 的可靠抑制劑，對(duì)于腫瘤的特異性治療具有重要意義。

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