羅金英，鐘建鑫，舒紹兵，3，張 潔，朱 璨，張 倩，湯 玲，周繼祥 (.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院口腔科，重慶00038;2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院口腔科，重慶085;3.武警重慶總隊(duì)機(jī)關(guān)門診部口腔科，重慶07;.重慶大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，重慶000)

人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有高度增殖、自我更新、多向分化的潛能，是牙齒移動過程中的關(guān)鍵細(xì)胞，在矯治力作用下可分化為成骨細(xì)胞［1］，是矯治性牙槽骨應(yīng)力改建中成骨細(xì)胞的來源之一［2］。Hedgehog(Hh)信號通路對骨髓干細(xì)胞應(yīng)力成骨的調(diào)控具有重要作用，多種因素可直接或間接通過調(diào)控Hh信號通路從而使間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［3］。本課題組前期證實(shí)了周期性張應(yīng)力可促進(jìn)PDLSCs 向成骨細(xì)胞分化，并通過體外細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Hh 信號通路對PDLSCs 應(yīng)力成骨具有直接的調(diào)控作用［4-5］。Glil(Gliloma-associated oncogene homoglog)是Hh 信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，是該通路激活的最重要標(biāo)志［6-7］，其如何通過調(diào)控Hh 信號通路來影響PDLSCs 成骨的分子機(jī)制還少有研究。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建過表達(dá)Glil 基因腺病毒載體，并轉(zhuǎn)染PDLSCs 細(xì)胞，檢測其成骨標(biāo)志物的表達(dá)，探討上調(diào)Glil 基因?qū)DLSCs 增殖及成骨分化的影響，為進(jìn)一步研究Glil 基因在Hh 信號通路對人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過程中的作用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Ⅰ型膠原酶購于Sigma 公司，胎牛血清購于Gibco 公司，α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購于HyClone 公司。KOD-plus 高保真酶，限制性內(nèi)切酶EcoRv、Xba Ⅰ、Pme Ⅰ、Pac Ⅰ、連接酶T4Lignase 均購自TOYOBO 公司。Marker-DL15000、pAdTrack 腺病毒載體、293T 細(xì)胞均購自invitrogen 公司。Glil、Runx2 和ALP抗體購于Santa Cruz 公司。質(zhì)粒提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購于北京天根生物公司，LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于Invitrogen 公司，CD146 單克隆抗體購于Biolegend 公司，成骨、成脂誘導(dǎo)液購于賽業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 人牙周膜干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

本實(shí)驗(yàn)使用的標(biāo)本均來自于本科室12 ～24 歲因矯正需要拔除的健康牙。牙齒拔除前，行口腔潔治及常規(guī)消毒，用含1%青霉素-鏈霉素的PBS 沖洗3 ～5 遍，直到?jīng)_洗液不再渾濁。手術(shù)刀片輕輕單向刮取牙根中1/3 的牙周膜組織，眼科剪將組織塊剪至1 mm2大小，加入Ⅰ型膠原酶消化45 min，將組織混懸液接種于6 孔板。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 第1 次換液，待細(xì)胞密度達(dá)70% ～80%時傳代，傳至第3 代，通過流式分選技術(shù)獲得牙周膜干細(xì)胞。取第4 代PDLSCs 用胰蛋白酶消化，重懸，加入10 μl PBS 制成懸液，加入EP 管中，EP 管中加入CD146 抗體，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行表型分析。將4 ～6 代細(xì)胞以5 ×104的密度接種于內(nèi)置無菌玻片的24 孔板，制作細(xì)胞爬片，用免疫組化Envisionf 法對其波形蛋白及角蛋白進(jìn)行檢測。成骨誘導(dǎo):取第4 ～6 代PDLSCs 以2.5 ×104的密度接種于24 孔板中，培養(yǎng)4 d 后換液，加入成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)7 d 后，茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察是否有礦化結(jié)節(jié)形成。成脂誘導(dǎo):PDLSCs 在成脂誘導(dǎo)液下培養(yǎng)3 周，油紅染色后，倒置顯微鏡下觀察是否有脂滴的形成。

1.3 Glil 腺病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染牙周膜干細(xì)胞

1.3.1 重組質(zhì)粒PTA2 /Glil 的構(gòu)建 采用Gene Tool 軟件設(shè)計(jì)克隆Glil 基因引物序列為:上游:5’-GAAGATCTCGACTACCGCATCATCACAGC-3’，下 游:5’-GCTCTAGAATAGGGTTTCCAATGCTTCACTG-3’，RT-PCR 法，以人牙周膜細(xì)胞提取RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 為模板，擴(kuò)增Glil 基因的ORF 序列，克隆至載體PTA2，采用限制性內(nèi)切酶(EcoRv、XbaⅠ)和菌落PCR 法對重組子進(jìn)行初步鑒定，將陽性重組子的質(zhì)粒行測序鑒定，測序正確者命名為PTA2/Glil。

1.3.2 pAdTrack-CMV-Glil 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 以PTA2/Glil 為模板，引用T 載體酶切位點(diǎn)(EcoRv、Xba Ⅰ)，雙酶切PTA2/Glil、pAdTrack-CMV，膠回收Glil 目的基因及pAdTrack-CMV 線性化條帶，純化后連接，菌液PCR 和限制性內(nèi)切酶對重組子行初步鑒定，可疑陽性重組子送予測序，測序正確者被命名為pAdTrack-CMV-Glil。

1.3.3 腺病毒同源重組穿梭質(zhì)粒 用PmeⅠ線性化重組pAdTrack 穿梭質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入BJ5183 感受態(tài)細(xì)菌，與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1 同源重組，用卡那霉素篩選出單克隆。挑取單克隆菌落并抽提質(zhì)粒，重組質(zhì)粒用PacⅠ酶切鑒定。

1.3.4 腺病毒的包裝和擴(kuò)增 取含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液培養(yǎng)293 T 細(xì)胞，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)后并將細(xì)胞以每孔1 ×105細(xì)胞接種至6孔板，待其達(dá)到60% ～70%融合度，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將PacⅠ線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后便可觀察到綠色熒光。當(dāng)293 T 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變和CPE，則收取細(xì)胞和上清，在－80 ℃至室溫條件下反復(fù)凍融3 次，使細(xì)胞破裂后釋放出腺病毒，經(jīng)0.45 μm 過濾掉細(xì)胞碎片后得到第1代腺病毒。用第1 代腺病毒感染293T 細(xì)胞可得到第2 代腺病毒。重復(fù)5 次后可得到純的重組腺病毒。

1.3.5 Glil 腺病毒載體轉(zhuǎn)染牙周膜細(xì)胞 將4 ～6 代牙周膜細(xì)胞接種至6 孔板，待細(xì)胞長至70% ～80%時，更換無抗生素?zé)o血清培養(yǎng)基，加入15 μl 左右的病毒液，2 h 后培養(yǎng)基更換含10%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h 于倒置熒光顯微鏡下觀察，帶綠色熒光的細(xì)胞為陽性，觀察熒光及細(xì)胞病變(CPE)以判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Glil 在感染病毒后的PDLSCs 中的表達(dá)

腺病毒轉(zhuǎn)染PDLSCs 后24 h 和48 h，分別收集2 瓶密度為1 ×106的細(xì)胞，加入蛋白裂解液，電泳、轉(zhuǎn)膜后，加入一抗過夜，孵二抗，Western blot 檢測Glil 蛋白在PDLSCs 中的表達(dá)。

1.5 CCK-8 檢測腺病毒轉(zhuǎn)染后的PDLSCs 增殖能力

牙周膜干細(xì)胞以1 ×104的密度接種于96 孔板中，分別為Glil 基因腺病毒載體組、空載體組、對照組(未加病毒)，每組5 個副孔，檢測前加入含10 μl CCK-8 液的培養(yǎng)基共100 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，測定450 nm 處光密度值D(450)，連續(xù)檢測6 d。

1.6 細(xì)胞分化能力檢測

腺病毒轉(zhuǎn)染PDLSCs 后，分別培養(yǎng)24 h、48 h 后提取蛋白，Western blot 檢測其中Glil、ALP 以及Runx2 的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜干細(xì)胞鑒定

流式細(xì)胞儀表型分析CD146 陽性率為94.8%。免疫組化染色角蛋白陰性，波形蛋白陽性(圖1a、圖1b)，說明所得細(xì)胞為間充質(zhì)來源。成骨誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)3 周后，鏡下觀有散在的礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽性(圖1c)。成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn):成脂誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞3 周后，胞漿內(nèi)可見脂滴出現(xiàn)，對其進(jìn)行油紅O 染色，可見細(xì)胞內(nèi)有大小不一的紅色脂滴(圖1d)。

2.2 Glil 病毒載體的構(gòu)建及鑒定

將目的基因Glil 亞克隆至pAdtrack-CMV 載體后，選用EcoRv+ XbaⅠ酶切鑒定，電泳顯示約3 300 bp 的目的片段與約9 200 bp 的pAdtrack-CMV 骨架片段見圖2，經(jīng)測序證實(shí)，帶有Glil 基因的pAdtrack-CMV-Glil 載體構(gòu)建成功。利用脂質(zhì)法包裝pAdtrack-CMV-Glil 病毒載體，將其感染293T 細(xì)胞2 d 后，熒光顯微鏡下觀察90%以上細(xì)胞有熒光，光鏡下觀察有空斑形成(圖3)。

2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染PDLSCs 及過表達(dá)Glil

過表達(dá)Glil 腺病毒轉(zhuǎn)染PDLSCs，培養(yǎng)48 h 后，顯微鏡下觀察帶綠色熒光細(xì)胞達(dá)90%以上。分別在腺病毒轉(zhuǎn)染后的24 h、48 h 收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot 檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h 后Glil 蛋白表達(dá)較對照組未增加［灰度值(0.041 ±0.024)和(0.036 ±0.017)，P ＞0.05］，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;48 h 后Glil 蛋白表達(dá)較對照組增加［灰度值(0.041 ± 0.024)和(0.148 ± 0.017)，P ＜0.05］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明該時間點(diǎn)的PDLSCs 細(xì)胞成功過表達(dá)Glil 基因，見圖4。

2.4 上調(diào)Glil 可使PDLSCs 的增殖能力減弱

腺病毒轉(zhuǎn)染人牙周膜干細(xì)胞后，檢測1 ～6 d 人牙周膜干細(xì)胞的增殖情況，6 d 后比較空載體組和過表達(dá)組的增殖情況，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組增殖速率明顯減慢(P =0.003)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5)，說明上調(diào)Glil 基因可使PDLSCs 增殖速率減慢。

2.5 上調(diào)Glil 基因增強(qiáng)PDLSCs 成骨分化能力

過表達(dá)Glil 的腺病毒轉(zhuǎn)染PDLSCs 48 h 后，Western blot 檢測成骨標(biāo)志物ALP 表達(dá)顯著升高。空白對照組與48 h 過表達(dá)組［(0.154 ±0.213)和(0.237 ±0.256)，P ＜0.05］差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。Western blot 檢測成骨標(biāo)志物Runx2 表達(dá)也顯著升高。空白對照組與48 h 過表達(dá)組［(0.167 ±0.008)和(0.223 ±0.090)，P ＜0.05］差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。說明過表達(dá)Glil 基因可以促進(jìn)PDLSCs 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

圖1 人牙周膜干細(xì)胞鑒定(倒置顯微鏡)

圖2 腺病毒載體鑒定

圖3 Glil 病毒載體的構(gòu)建

圖4 過表達(dá)Glil 腺病毒轉(zhuǎn)染PDLSCs 后Glil 蛋白表達(dá)增加

圖5 上調(diào)Glil 后PDLSCs 的增殖能力檢測結(jié)果

圖6 上調(diào)Glil 基因PDLSCs 成骨分化能力檢測結(jié)果

3 討論

對于Hedgehog(Hh)信號通路的早期研究是其在哺乳動物胚胎發(fā)育階段的作用和它的過度激活與眾多腫瘤的發(fā)生有關(guān)，近年來，Hh 信號通路在骨的形成發(fā)育中的作用越來越受到學(xué)術(shù)界重視。激活的Hh 信號通路主要通過影響干細(xì)胞的增殖及分化而實(shí)現(xiàn)對成體組織功能穩(wěn)定的調(diào)節(jié)［8］。若在胚胎發(fā)育過程中缺失Hh 基因，將會導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼發(fā)育畸形［9］，Hh 蛋白可以通過促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化或直接作用于成骨細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)成骨細(xì)胞分化并參與骨形成［10-11］。ALP 作為成骨細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，它可破壞鈣通道抑制劑，從而啟動鈣化過程，是成骨分化的開始，是成骨細(xì)胞早期分化的重要酶［12-13］。Runx2 在骨形成過程及成骨細(xì)胞分化中起著控制作用，尤其是對間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的調(diào)節(jié)具有重要作用，是骨形成的關(guān)鍵基因，也是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志［14-15］。ALP、Runx2 是成骨過程中不同階段的標(biāo)志物，它們的表達(dá)水平反映了PDLSCs 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。本研究發(fā)現(xiàn)，正常組、空載組細(xì)胞及含目的基因病毒感染的PDLSCs 24 h時均能表達(dá)ALP 及Runx2，但Glil 的表達(dá)沒有明顯差異，說明PDLSCs 本身具有向成骨細(xì)胞分化的能力。當(dāng)Glil 目的基因病毒感染PDLSCs 48 h 后，Glil 的表達(dá)水平升高，ALP、Runx2 的表達(dá)也明顯增加，這表明上調(diào)Glil 能促進(jìn)PDLSCs 向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

Hh 信號通路主要由Hh 配體、Smo(Smoothened)跨膜蛋白、Ptch(Patched)受體、Hip、核轉(zhuǎn)錄因子Glil 組成。在沒有Hh 蛋白時，PTCH 與SMO 結(jié)合，抑制了SMO 的活性，當(dāng)Hh 蛋白從分泌細(xì)胞分離并轉(zhuǎn)運(yùn)至效應(yīng)細(xì)胞后，Hh 蛋白與效應(yīng)細(xì)胞膜上的PTCH 受體結(jié)合，將SMO 釋放，從而把Hh 信號傳至效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)，激活胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Gli 蛋白，促使目標(biāo)基因得以表達(dá)［16-17］。Glil 是一種鋅指蛋白，在哺乳動物中有3 種Glil 基因，其中Glil 不僅與效應(yīng)細(xì)胞的成骨作用相關(guān)，而且通過Hh 蛋白激活表達(dá)，對Hh 起正反饋調(diào)節(jié)作用。Glil 激活Hh 信號，進(jìn)而激活Hh 信號通路，誘導(dǎo)一系列下游信號分子的釋放，從而發(fā)揮其調(diào)控作用。由此可見Glil 是Hh 信號通路最重要的下游轉(zhuǎn)錄因子，也是Hh 信號通路的靶基因，是公認(rèn)的Hh 信號通路被激活的重要標(biāo)志物，在此通路中起著至關(guān)重要的承上啟下的作用。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了過表達(dá)Glil 目的基因的腺病毒載體并轉(zhuǎn)染PDLSCs，轉(zhuǎn)染效率較高，轉(zhuǎn)染48 h 后，Western blot檢測Glil 表達(dá)增加，說明成功上調(diào)了Glil 基因在PDLSCs中的表達(dá)。含目的基因的腺病毒感染PDLSCs 后，檢測其增殖能力有所下降，其成骨相關(guān)指標(biāo)ALP、Runx2 表達(dá)有所增加，說明PDLSCs 的成骨分化能力增強(qiáng)。

綜上所述，本研究通過基因重組技術(shù)研究了Glil對牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響，進(jìn)一步證實(shí)了Hh通路對牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究Hh 信號通路對PDLSCs 應(yīng)力成骨調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)，也為臨床矯治過程中牙的移動及牙周病治療中骨的再生提供了一定的理論依據(jù)。

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