陳龍 梁子寧 朱華

（廣西中醫(yī)藥大學，南寧　530001）

植物內生菌研究進展

陳龍 梁子寧 朱華

（廣西中醫(yī)藥大學，南寧530001）

植物內生菌是指生活史中某一階段生活在植物組織內，對植物沒有明顯病害癥狀的一類微生物，研究發(fā)現(xiàn)其主要包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌。內生菌能夠產生與宿主植物相同或相似的活性物質，從而拓寬了藥用資源并且具有巨大的應用價值。從植物內生菌的分布規(guī)律及其生長特點，與宿主植物的關系，研究領域以及發(fā)展現(xiàn)狀與存在問題等方面進行了綜述，并對植物內生菌在藥用資源開發(fā)中的前景進行了展望。

植物內生菌；與宿主植物關系；生物活性；研究領域

植物內生菌是指其生活史中某一階段或整個階段生活在生長健康的植物組織或細胞內，并對宿主植物沒有引起明顯病害癥狀的一類微生物群，其主要包括內生細菌、內生真菌、內生放線菌這三種類群［1］。由于近代農業(yè)，畜牧業(yè)，食品加工業(yè)幾次重大的中毒事件植物內生菌才逐漸引起人們和科學家的重視。因此，關于植物內生菌的研究才慢慢的開展起來。直至1993年Stierle報道了從短葉紅豆杉（Taxusbrevifolia Nutt.）中能分離出一種能產生抗癌活性成分紫杉醇的內生菌［2］。至此人們經過數十年的研究發(fā)現(xiàn)，植物內生菌和其宿主之間存在著相互依存及互惠的關系。目前，人們已經漸漸地從植物內生菌中尋找到與宿主相似的天然化合物成分，這不僅拓寬了藥用植物資源，同樣也促進了對稀有珍貴物種的保護和持續(xù)發(fā)展。除此之外，對植物內生菌的次生代謝的研究也悄然展開。近幾年，有研究表明從植物內生菌中分離出的次生代謝產物也存在著生物活性成分［3］。當前，植物內生菌的研究已經成為植物學、植物保護學、農藥學、生藥學和中藥資源學等學科領域的研究熱點，其在農業(yè)、林業(yè)及醫(yī)藥領域具有重要的研究開發(fā)價值。本文就近10年來植物內生菌及其代謝產物的相關研究作如下簡要綜述。

1 植物內生菌的分布規(guī)律

植物內生菌普遍存在于植物的根莖葉花果實等器官和組織細胞中，并且廣泛地存在于藻類、苔蘚、蕨類植物、裸子植物和被子植物中。目前，植物內生菌的研究主要集中在裸子植物和被子植物這兩類植物。內生菌的分布規(guī)律取決于宿主本身及內生菌的種類，在宿主不同器官的分布存在著差異［4-10］。研究表明，植物內生菌的分布規(guī)律受植物的種類、地理位置、生長環(huán)境和氣候條件等因素的影響。因此內生菌也具有豐富的生物多樣性。植物內生菌的種類繁多，但主要包括真菌、細菌和放線菌，其中內生真菌是當前內生菌研究的熱點。

2 內生菌與宿主植物之間的關系

內生菌和宿主植物由于二者生活環(huán)境和習性的不同，因此也決定了二者之間關系的復雜性和特殊性。對于內生菌的起源有學者認為，內生菌可能通過多種途徑從宿主體外進入宿主體內。如宿主植物及種子的表面，自然孔口處或傷口處和直接破壞細胞壁成分侵入等［11，12］。內生菌與宿主在長期共處這種復雜而又特殊的關系中，會因自身生理狀況，環(huán)境變化等內外因素的變化而發(fā)生相互轉化［11］。同時，不同的內生菌對宿主的專一性也有很大差別。有的只與一種植物共生，有的可以和多種植物共生［13］。

2.1 內生菌對宿主植物的影響

2.1.1 促進宿主植物的生長 許多研究表明，內生菌可促進宿主植物的生長發(fā)育，增加宿主植物的總生物量，單株花序數量和種子數量，提高植物種子的飽滿率和發(fā)芽率，促進幼苗存活和分蘗生長等［14］。內生菌的這種促進植物生長作用可以從兩方面理解［15-19］。一方面，許多內生真菌可以產生生長素、赤霉素和細胞激動素等植物生長激素；另一方面，內生菌能夠增加植物的固氮能力和對鉀、鈣、磷等營養(yǎng)元素的吸收。

2.1.2 增強宿主植物的抗逆性 內生菌能夠增強宿主植物在不利的外界環(huán)境中的抗性，主要表現(xiàn)在抗旱、耐熱、抗病蟲害和對病原體拮抗等方面。研究表明，感染內生菌的植物比未感染的植物在應激環(huán)境中的適應性明顯增強。許多資料證明內生菌與植物的共生協(xié)助了早期植物在一些惡劣、貧瘠的土壤上生存。當植物感染內生菌后，其某方面的抗逆性明顯增強，從而提高了該植物在逆境環(huán)境中存活的幾率［10，11，20，21］。

2.1.3 對宿主植物的毒性作用或抑制作用 內生菌在侵染宿主初期或者在長期的共存中，由于外界環(huán)境的改變，以及非寄主生物的入侵而產生有毒物質或溶解酶。這種毒性物質和溶解酶一般是非專一性的，會對宿主植物細胞組成，植物的生理功能以及對其敏感的非寄主生物造成毒害損傷或抑制作用，從而促進其生長或是獲取有利的生長空間和營養(yǎng)物質［11，22，23］。

2.1.4 促進宿主植物次生代謝產物的產生 內生菌能夠促進宿主植物次生代謝產物的產生，可能主要由以下兩種原因造成：第一種可能，由于內生菌和宿主植物在基因層面的變化產生了信息傳導通路，導致其與宿主產生相同或相似的次生代謝產物［11，14］；第二種可能，內生菌參與了宿主植物體內的生物合成代謝。內生菌在次生代謝產物的合成途徑中協(xié)同或催化關鍵酶類或蛋白的合成［24，25］。

2.2 宿主植物對內生菌的影響

內生菌對于植物來說始終是一個異物。當內生菌侵入植物體時，植物自身會對其產生應激反應。這種反應一般可能分為兩種，一種呈現(xiàn)抵抗作用［11，22，23］，如形成機械障礙；另一種與植物體形成共生結構［26，27］，如蘭科植物的菌根。

2.2.1 宿主植物對內生菌的抵抗反應 對于植物對侵入自身的內生菌的抵抗作用，研究認為在宿主植物和侵染的內生菌或病原菌都是受特殊基因控制的。特殊基因的調控作用控制著植物是否具有抵抗作用。當植物細胞表面具有與病原菌表面互補的糖蛋白時，植物的抵抗作用會因此受到激發(fā)，其本身產生抗病性。反之，植物由于不能產生抗病性蛋白而感?。?2，28］。

侵入的內生菌不能適應宿主植物的內環(huán)境也是宿主植物對內生菌的抵抗反應的一種表現(xiàn)形式，即植物本身不能為寄主內生菌的生長提供必需的營養(yǎng)物質和適宜的生長環(huán)境［22，23］，如溫度、溫度、氧氣和酸堿度等。

除此之外，宿主植物體內存在著內生菌萌發(fā)，生長的抑制因子。如體內含有一些化學成分能夠抑制真菌孢子的萌發(fā)［29］；或是宿主植物本身細胞結構或者真菌侵染后的應激反應導致宿主植物細胞結構改變，給內生菌在宿主植物內部的定殖、生長和孢子的萌發(fā)形成了機械障礙［11，22］。如細胞壁增厚、營養(yǎng)流失等。

2.2.2 宿主植物與內生菌形成共生體 有些內生菌侵入宿主植物內部以后，會與宿主本身形成一種有規(guī)律的互利結合的共生體。這種共生結構使內生菌和宿主植物在生理結構，營養(yǎng)物質輸送，能量分配等方面達到了一種平衡。這種平衡關系的建立和穩(wěn)定，是維護內生菌和宿主植物的共生生活的關鍵，同時對于內生菌和宿主植物二者本身的生長生活又有互利互惠作用，彼此通過自己本身的生長特點和結構特點來彌補對方生長的缺陷或對外界艱苦環(huán)境的適應。如蘭科植物天麻和密環(huán)菌，松科植物的菌根菌［30，31］。

2.2.3 內生菌對植物宿主的優(yōu)勢選擇 宿主植物的內環(huán)境是內生菌賴以生存的外界環(huán)境。不同的宿主植物對內生菌的影響是不同的。即便是同科同屬中該植物的不同變種，內生菌也會選擇那些利于自己的生長的植物宿主。王梅霞等［32］研究發(fā)現(xiàn)杜仲（Eucommia ulmoides）葉片中內生真菌的類群存在著優(yōu)勢群落現(xiàn)象，而且在兩地之間植物組織中的優(yōu)勢群落存在著不同程度的差異。

3 植物內生菌的研究內容

3.1 菌株的分離純化

常采用組織塊法［4-6，33，34］。在宿主細胞不同組織器官中，如根、莖、葉、花及果實等取若干克或小塊（根據具體實驗而定）并按常規(guī)程序進行消毒。無菌條件下將處理后的植物組織（枝條、根的韌皮部或葉子等）切成適當大小的小方塊。將其放在PDA或其他培養(yǎng)基上，25-30℃，培養(yǎng)3-7 d。待組織塊段面邊緣有菌絲長出后，挑去前端菌絲轉入另一PDA平板培養(yǎng)基，經純化，得到單一菌落后，斜面保存?zhèn)溆谩嶒灥姆椒ú襟E可根據實驗要求進行調整。除此之外，還可根據分離目的的不同，選擇含有不同培養(yǎng)基質的分離培養(yǎng)基分離目標菌種。如含抑菌劑的培養(yǎng)基，含植物組織提取的培養(yǎng)基和低營養(yǎng)的培養(yǎng)基［35-37］。

3.2 菌株生物形態(tài)特性及種類鑒定

內生菌的形態(tài)結構和生理結構易受到培養(yǎng)環(huán)境的影響，給研究菌株工作帶來了很大的難度。利用生物形態(tài)學特性研究，不僅能夠確定菌株的性狀大小，顏色紋飾和菌落形態(tài)和質地等生理習性，同時又能為菌株的分類鑒定提供依據［38，39］。因此對菌株生物特性研究已經成為人們研究內生菌的一項重要方法。通常對菌株生物特性研究主要分為營養(yǎng)因子和物理化學因子兩部分［23，38，39］。如菌株的碳源、氮源、無機鹽、生長因子、維生素等營養(yǎng)因子和溫度，濕度、光照、空氣和PH值等物理化學因子。

由于內生菌的形態(tài)結構受到培養(yǎng)環(huán)境的影響，所以通過菌絲形態(tài)、產飽結構和形態(tài)，依靠生物形態(tài)學鑒定已難以準確鑒定出內生菌的屬種。分子生物學方法是通過測定菌株的核酸組成來判斷菌株的親緣關系，從而克服和彌補了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的不足［38-40］。目前，對于菌株的鑒定主要采取以分子生物學方法為主，經典生物形態(tài)學觀察法為輔的方式來確定菌株的屬種。

3.3 菌株及其次生代謝產物的生物活性及成分研究

植物內生菌及其次生代謝活性成分通常具有抗腫瘤、抑菌及殺蟲的作用［3-5，10，41-43］。因此，通過分離植物內生菌來獲得具有生物活性的化學成分研究已經成為醫(yī)藥和農業(yè)生物防治領域開發(fā)研究的一個熱點。相關研究文獻表明，其作用機制主要分別為阻斷或干擾促進腫瘤細胞分裂的關鍵酶類及蛋白質的合成，破壞細菌細胞壁和細胞膜的結構，改變細胞膜的通透性，或是阻礙細菌蛋白質的合成及表達，最終致使細菌正常生理功能受損而死亡以及產生具有細胞毒性的成分改變害蟲的生理功能或細胞結構［9，22，28，41-44］。隨著分離純化技術的快速發(fā)展，以及高效液相、氣質聯(lián)用及核磁共振等化學結構測定新技術和方法的應用。從植物內生菌種分離出的藥用活性成分不斷增加，主要包括多糖、多肽類、萜類、醌類、黃酮類、生物堿類、芳香類和脂肪酸類等化合物［8，9，25，39，41-48］。

4 內生菌在藥用植物中的研究現(xiàn)狀

經過不斷的研究探索，我們可以確定植物內生菌能夠產生與宿主植物相同或相似的特有藥用成分，這不僅拓寬了藥用資源，同時也使一些瀕臨滅絕的珍貴物種得到一定程度的保護。除此之外，內生菌還影響著藥用植物的道地性［13，14］。但是從眾多研究實驗及文獻記載中可以看出，藥用植物內生菌的研究主要集中在被子植物和裸子植物，而在蕨類植物和苔蘚類植物的研究非常少。同樣，對內生真菌的研究也要比內生細菌和放線菌多，研究有益菌比有害菌多，并且研究的方法和手段比較單一，而對于內生菌的起源以及作用機理目前還不明確［49］。

5 展望

綜上所述，植物內生菌種類豐富蘊藏量大，加之其特殊的生存方式，因此對于藥用資源的開發(fā)，是一個擁有巨大開發(fā)潛力的寶庫。但目前對植物內生菌的研究還處于探索階段，研究的領域比較有限。例如，對植物內生菌的研究多，而對動物內生菌的研究較少［50］。在研究方法和技術上，對植物內生菌的研究也主要集中在對能產生與宿主植物相同或相似活性物質的內生真菌篩選上，其涉及的研究領域比較局限。未來的研究中應重視內生菌起源以及與宿主植物之間作用機理的研究。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Advances in the Studies of Plant Entophytic

Chen Long Liang Zining Zhu Hua
（Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning530001）

Entophyte is a kind of micro living organism that lives within a plant for at least a certain period of its life without causing apparent symptoms of disease to the plant. The studies found out that it mainly includes entophytic bacteria， entophytic fungi， and entophytic actinomycetes. Entophyte can produce active substances similar to that of the host plant， which thereby broadens the medicinal resources and correspondingly have a great application value. The authors summarize the following aspects: the distribution patterns and growing characteristics of entophyte， its symbiotic relationship with the host plant， its research fields and current situation of development， together with existing problems. Also， authors forecast the prospects of entophytes utilized in the development of medicinal resources.

plant entophyte；symbiotic relationship with the host plant； bioactivity； research field

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.005

2014-11-19

廣西研究生教育創(chuàng)新計劃（YCSZ2014171），廣西壯族自治區(qū)自然科學基金項目（2012GXNSFAA053119）

陳龍，男，碩士研究生，研究方向：中藥資源開發(fā)與利用；E-mail：chenglong198808@yeah.com

梁子寧，博士，副教授，研究方向：藥用植物資源評價與開發(fā)利用；E-mail：381668307@qq.com