伏慧慧，譚梅，郭艷秋，侯太芳，張麗，2，宋麗軍，2，*

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

響應面法優(yōu)化“酶法-超聲波”連續(xù)提取核桃青皮多酚

伏慧慧1，譚梅1，郭艷秋1，侯太芳1，張麗1，2，宋麗軍1，2，*

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

為了優(yōu)化核桃青皮中多酚類物質(zhì)的“酶法-超聲波”連續(xù)提取工藝，在單因素試驗基礎上，通過Design Expert 8.05軟件進行響應面設計與優(yōu)化，得到了預測數(shù)學模型。結果表明，酶法提取最佳工藝條件為：采用纖維素酶，酶解溫度55.00℃、酶解pH 5.00、酶解時間75.00min、酶添加量15.00 U/mL、液料比30∶1mL/g。酶解后繼續(xù)采用超聲波輔助二次提取，以50%“乙醇-水”為提取液，超聲時間45min、超聲溫度50℃、超聲功率100W，此條件下多酚提取率為61.36%。

響應面；纖維素酶；超聲波；核桃青皮；多酚

核桃青皮，又稱青龍衣，是核桃加工過程的的主要副產(chǎn)物。核桃青皮中含有豐富的多酚類化合物，如綠原酸、香草酸、槲皮素、沒食子酸、核桃酮等[1-3]，具有較強的抗氧化活性，有抗衰老、治療心腦血管疾病、降血脂、抗癌、抗輻射等生理活性[4-5]。據(jù)統(tǒng)計，截止2010年底，新疆核桃青皮產(chǎn)量已達到13.41萬t[6]，但長期以來，核桃青皮均作為廢渣拋棄，造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費，因此，有效利用新疆核桃青皮資源顯得極為重要。

近年來，酶法、超聲波、微波、超臨界CO2等提取技術已在中藥材及食品的生物活性成分提取領域得到了廣泛應用，如多糖[6]、功能油脂[7]、石榴皮多酚[10]、皂甙[11]、茶多酚[13-16]、葡萄多酚[17-18]、余甘子多酚[19]、板栗多酚[20]、蘋果多酚[21]等物質(zhì)提取方面得到了深入研究，然而“酶法-超聲波”連續(xù)提取在核桃青皮多酚提取中的研究卻鮮見報道。

本文以新疆薄皮核桃溫185青皮為原料，采用酶法提取其中多酚類物質(zhì)，并利用超聲波輔助“乙醇-水”溶液進行二次提取。以響應面設計優(yōu)化“酶法-超聲波”連續(xù)提取核桃青皮多酚的最佳工藝，為新疆核桃青皮多酚提取提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

核桃青皮：由于不同品種、生長期的核桃中多酚含量差異較大，本試驗原料一次性采集。新疆薄皮核桃溫185核桃青皮，樹齡21年～23年，2012年10月2日購于新疆阿拉爾市。

福林-酚試劑：Sigma公司；沒食子酸標準品：Sigma公司；

果膠酶，纖維素酶：南寧市基亞實驗用品公司；中性蛋白酶：上海藍季科技有限公司；乙醇、無水碳酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9101-1S減壓干燥箱：上海鴻都電子科技有限公司；HH-S6恒溫水浴鍋：上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；FZ102粉碎機：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機：北京陽光思特生物技術有限公司；SB-3200DTDN超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國華生化儀器股份公司；島津UV-Mini1240型紫外可見分光光度計：日本島津公司；MA110型電子天平：上海臺衡儀器儀表有限公司。

1.3 提取工藝及要點

核桃青皮→預處理→減壓干燥→粉碎、過篩→樣品-酶-緩沖液混合→恒溫震蕩提取→加入乙醇→超聲輔助二次提取→離心→上清液→測定總多酚。

操作要點：

1）核桃青皮切分后于50℃減壓干燥，粉碎，過80目篩，置于棕色瓶中密封，-18℃冷凍保藏備用。

2）酶法提取：取5 g粉末與提取溶液（酶-磷酸鹽緩沖液體系）混合，在恒溫振蕩器中避光提取。為避免有機溶劑引起酶變性，本試驗在第一提取階段采用水提取，然后在提取后的溶液中加入乙醇（使最終比例為乙醇∶緩沖液=1∶1）進行超聲波輔助二次提取，離心后取上清液測定總多酚含量。

3）二次提取工藝：本試驗確定采用“乙醇∶水=1∶1”的溶液為溶劑，采用超聲波輔助二次提取超聲功率100W，時間45min，溫度50℃（避光）。離心后取上清液測定多酚含量。

1.4 試驗方法

1.4.1 定性試驗[2，4]

根據(jù)參考文獻[2，4]對提取液進行多酚類定性分析。

1.4.2 總多酚測定

采用福林-酚法測定，參見參考文獻[11-13]。

沒食子酸標準溶液標準曲線為：y=0.102 5 x－0.009 1（R2=0.998 3）。

總多酚測定：取離心后的上清液1.0mL，按上述沒食子酸標準曲線制作方法測定吸光度，計算樣品中的多酚提取率。樣品中的多酚以沒食子酸的含量表示，單位為mg/g。

多酚提取率（%）=[提取液中多酚含量（g）/原料中多酚含量（g）]×100%。

1.4.3 酶法提取核桃青皮多酚工藝

1.4.3.1 酶的選擇

分別選擇纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等，在其最佳酶解溫度、酶解pH條件下，分別酶解3.0 h，測定多酚提取率。

1.4.3.2 溫度對多酚提取率的影響

在酶解pH 5.0、時間60 min、酶添加量12 U/m L、液料比30mL/g條件下，分別設置酶解溫度30、40、50、60、70℃，考察溫度對多酚提取率的影響。

1.4.3.3 酶解pH對多酚提取率的影響

在酶解時間60min、酶添加量12 U/mL、液料比30mL/g、溫度50℃條件下，分別設置酶解pH為3.5、4、4.5、5、5.5、6，考察酶解pH對多酚提取率的影響。

1.4.3.4 酶解時間對多酚提取率的影響

在酶解pH 5.0、溫度50℃、酶添加量12U/mL、液料比30m L/g條件下，分別設置酶解時間為30、50、70、90、110、130min，考察酶解時間對多酚提取率的影響。

1.4.3.5 酶添加量對多酚提取率的影響

在酶解溫度50℃、pH 5.0、時間60min、液料比30mL/g條件下，分別設置酶解酶添加量3、6、9、12、15、18U/mL，考察酶添加量對多酚提取率的影響。

1.4.3.6 液料比對多酚提取率的影響

在酶解溫度50℃、pH 5.0、時間60min、酶添加量12U/m L條件下，分別設置液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1mL/g，考察液料比對多酚提取率的影響。

在上述單因素試驗的基礎上，采用響應面設計優(yōu)化“酶法-超聲波”聯(lián)合提取核桃青皮多酚工藝。

2 結果與分析

2.1 多酚類定性試驗

多酚類定性試驗見表1。

由表1可知，定性試驗均顯示陽性結果，說明核桃青皮提取物中含有多酚類物質(zhì)。

2.2 酶法輔助提取核桃青皮單因素分析

2.2.1 酶的選擇

不同種類的酶處理對多酚提取率的影響見圖1。

由圖1可知，試驗過程所用的4種酶對多酚提取均有促進作用。其中纖維素酶的得率最高，達到43.20%（對照樣為26.59%）。因選擇纖維素酶作為后續(xù)試驗用酶制劑。

2.2.2 酶解溫度對多酚提取率的影響

酶解溫度對核桃青皮多酚提取率的影響見圖2。

由圖2可知，酶解溫度對核桃青皮多酚具有顯著影響。在一定范圍內(nèi)，多酚提取率隨著溫度的升高而增加，當溫度達到50℃～60℃時，多酚提取率達到最大；當溫度高于60℃時，多酚提取率隨溫度的升高而逐漸減少，可能原因是高溫導致酶的活性降低，且過高的溫度也會對已溶出的多酚類物質(zhì)起到破壞的作用[11]。故選擇酶解溫度為50℃，此時多酚提取率為54.76%。

2.2.3 酶解pH對多酚提取率的影響

酶解pH對核桃青皮多酚提取率的影響見圖3。

由圖3可知，pH 5.0時，多酚提取率達到最大值；pH偏離該范圍時，多酚提取率顯著減小。原因為酶的活性受環(huán)境pH的影響很大，在酶的最適pH條件下，酶反應速率達到最大，高于或低于該最適pH，反應速度都會下降[5]。故將最佳提取pH確定為5.0，此時多酚提取率為54.74%。

2.2.4 酶解時間對多酚提取率的影響

酶解時間對核桃青皮多酚提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著酶解時間的延長多酚提取率明顯增高，當酶解時間為70min時，多酚提取率達到最高值57.56%；繼續(xù)延長酶解時間，多酚提取率增加不顯著。因此，選擇最佳的酶解時間為70min。

2.2.5 酶添加量對多酚提取率的影響

酶添加量對核桃青皮多酚提取率的影響見圖5。由圖5可知，多酚提取率隨酶添加量的增大而增大，這是由于纖維素酶催化核桃青皮細胞壁纖維素物質(zhì)的水解，導致細胞壁結構損壞，細胞膜透性增加[8]，利用多酚類物質(zhì)的溶出。在酶添加量為12U/mL時，多酚提取率為58.68%；繼續(xù)增加酶量，多酚提取率雖略有增加，但幅度不大。綜合提取效果及成本因素，選纖維素酶的酶添加量為12U/mL。

2.2.6 液料比對多酚提取率的影響

液料比對核桃青皮多酚提取率的影響見圖6。

由圖6可知，當液料比小于30∶1時，隨著液料比的增大，多酚的得率迅速由35.41%增大至56.16%。當液料比大于30∶1時，多酚提取率雖略有增加，但增幅不大?？紤]到后續(xù)的超聲波輔助二次提取工藝，以及降低濃縮成本，增大溶劑的量對多酚提取的意義不大，因此選擇液料比30∶1mL/g。

2.3 響應面分析

在單因素試驗基礎上，選取溫度、pH、時間、酶添加量4個因素，運用Design Expert8.05軟件的Box-Behnken原理進行試驗設計。各因素及水平見表2。

響應面試驗設計及結果如表3所示。

以多酚提取率為響應值（Y），利用Design Expert 8.05軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到響應值對自變量的多元回歸方程：Y=58.75＋2.53A＋0.22B＋3.40C＋3.22D＋1.24AB-0.12 A C＋0.23AD-1.74BC＋0.15BD-2.30CD-2.63A2-3.47B2-1.80C2-0.32D2（1），其中，Y為核核桃多酚提取率的預測值，A、B、C、D分別為上述4個自變量的編碼值。

由表4可以看出：Fmodel=499.2，P＜0.000 1，表明模型（1）極顯著，R2=0.998 0，Adj R2=0.996 0，Pred R2=0.989 6，Adeq Precision=73.632，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，該模型可以用來分析和預測“酶法-超聲波”聯(lián)合提取核桃青皮多酚的效果。

模型（1）中一次項A、C和D極其顯著，B顯著，交互項AB，BC和CD極其顯著，A2、B2、C2極其顯著。對表2的數(shù)據(jù)進行回歸分析，剔除不顯著交互項，得到核桃青皮多酚提取率（%）對各自變量的標準回歸方程為：Y=10.5＋0.43A＋0.037 B＋0.58C＋0.55D＋0.21AB-0.30BC-0.39CD-0.45A2-0.59B2-0.31C2-0.055D2（2），各自變量對響應值的影響大小順序為：C＞D＞A＞B。

圖7為不同因素間交互作用對核桃青皮多酚提取效果的影響。通過等高線可直觀地反映出不同變量間交互作用的顯著程度，等高線越扁平說明因素之間交互作用越顯著，對Y值（多酚提取率）的影響越大。由圖7可知：溫度和pH、pH和酶解時間、酶解時間和酶添加量交互作用的等高線均呈現(xiàn)橢圓、扁平狀，表示上述因素之間的相互作用顯著。

2.4 驗證試驗

根據(jù)軟件和模型進行參數(shù)優(yōu)化分析，得到核桃青皮多酚“酶法-超聲波”聯(lián)合提取的最佳工藝條件為：溫度55.40℃，pH 5.04、時間74.93min、酶添加量15.00U/mL、液料比30∶1mL/g，在此條件下預測得率為62.54%。結合實際操作情況，將上述最優(yōu)工藝調(diào)整為：溫度55.00℃，pH 5.00、時間75.00min、酶添加量15.00U/mL、液料比30∶1mL/g，并在此優(yōu)化工藝條件下進行驗證試驗。3次驗證試驗多酚提取率為61.36%，驗證值與預測值相對誤差相差較小，說明了模型的有效性。

3 結論

本試驗在單因素基礎上，通過響應面法優(yōu)化了“酶法-超聲波”聯(lián)合提取核桃青皮多酚的最佳工藝，建立了可用的二次多項預測模型。各因素對多酚的影響順序為：酶解時間＞酶添加量＞酶解溫度＞酶解pH。最佳工藝參數(shù)為：粉碎粒度80目、酶解溫度55.00℃、酶解pH 5.00、酶解時間75.00min、酶添加量15.00U/m L、液料比30：1mL/g，酶解后繼續(xù)采用超聲波輔助二次提取法，以50%“乙醇-水”為提取液，超聲時間45min、超聲溫度50℃、超聲功率100W，此條件下多酚提取率為61.36%。

參考文獻：

[1]萬政敏.核桃青皮中多酚類物質(zhì)及其抗氧化性的分析[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2007

[2]Toshiyuki F, Hideyuki I, Takashi Y. Antioxidative polyphenols fromwalnuts (Juglans regia L.)[J]. Phytochemistry, 2003(63):795-801

[3]Oliveira, I, Sousa, A, Ferreira, I C F R, et al. Total phenols, antioxidantpotential and antimicrobial activity of walnut (Juglans regia L.)green husks[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(7): 2326-2331

[4]石碧,狄瑩.植物多酚[M].北京:科學出版社,2000:50-63

[5] Fernández-AgullóA,Pereira E,Freire M S,et al.Influence of solvent on the antioxidant and antimicrobial properties of walnut (Juglans regia L.)green husk extracts[J].Industrial Crops and Products,2013,42:126-132

[6]徐佳.核桃外果皮多酚提取純化及抗氧化活性研究[D].新疆農(nóng)業(yè)大學,2012

[7]王琛,石太淵.雙酶酶解法提取姜油樹脂工藝優(yōu)化[J].食品科學, 2011,32(12):60-63.

[8]王巖巖,郭盧云,劉濤,等.纖維素酶提取綠茶茶多酚的研究[J].食品工業(yè)科技,2011(7):326-328

[9]崔春蘭,鄭虎哲,顧立眾.響應曲面分析法優(yōu)化蘋果渣中多酚類物質(zhì)的果膠酶輔助提取工藝[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(9): 2235-2240

[10]李志洲,劉軍海.石榴皮中多酚類物質(zhì)的提取及其抗氧化性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009(11):152-155

[11]董旭,杜先鋒.響應面法優(yōu)化纖維素酶提取山核桃蒲多酚類物質(zhì)[J].食品科學,2013,34(4):109-113

[12]趙國建,王向東,王煥.提取方法對核桃青皮多酚提取效果的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學報,2012,28(1):351-355

[13]徐佳,辛立方,張瑞廷,等.改良的Folin-Ciocalteu比色法測定核桃外果皮中總多黔含量[J].食品工業(yè)科技,2012,33(6):60-63

[13]ZHANGG,ZHANG L,WUH,etal.Extraction of Tea-polyphenols from Tea Leaves by Ultrahigh Pressure Technique[J].Journal of Tea Science,2006,4:010

[14]Xi J,Shen D,Zhao S,et al.Characterization of polyphenols from green tea leavesusing a high hydrostatic pressure extraction[J].International journal of pharmaceutics,2009,382(1):139-143

[15]Todisco S, Tallarico P, Gupta B B. Mass transfer and polyphenols retentionin the clarification of black tea with ceramic membranes[J].Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2002 (3): 255-262

[16]ChandiniSK,Jaganmohan Rao L,Subramanian R.Influence of extraction conditions on polyphenols content and cream constituents in black tea extracts[J].International Journal of Food Science& Technology,2011,46(4):879-886

[17]GuerreroM S,Torres JS,Nu?ezM J.Extraction of polyphenols from white distilled grape pomace:optimization and modelling[J].Bioresource technology,2008,99(5):1311-1318

[18]Bucic-Kojic A,Planinic M,Tomas S,et al.Study of solid-liquid extraction kinetics of total polyphenols from grape seeds[J].Journal of Food Engineering,2007,81(1):236-242

[19]Yang L,Jiang JG,LiW F,et al.Optimum extraction process of polyphenols from the bark of Phyllanthus emblica L.based on the response surface methodology[J].Journal of separation science,2009, 32(9):1437-1444

[20]VázquezG,FreireM S,Santos J,etal.Optimisation of polyphenols extraction from chestnut shell by response surface methodology[J]. Waste and biomass valorization,2010,1(2):219-225

[21]Alonso-Salces R M,Korta E,Barranco A,et al.Pressurized liquid extraction for the determination of polyphenols in apple[J].Journal of chromatography A,2001,933(1):37-43

[22]Yilmaz Y,Toledo R T.Oxygen radical absorbance capacities of grape/wine industry byproducts and effect of solvent type on extraction of grape seed polyphenols[J].Journal of Food Composition and Analysis,2006,19(1):41-48

Optimization of Enzymatic-ultrasonic Continuous Extraction of Polyphenols from Walnut GreenPeels by Response Surface Methodology

FUHui-hui1，TANMei1，GUOYan-qiu1，HOUTai-fang1，ZHANGLi1，2，SONG Li-jun1，2，*
（1.College of Life Sciences，Tarim University，Alar843300，Xinjiang，China；2.Xinjiang Production and Construction CorpsKey Laboratory to Process of Agricultural Products in Southern Xinjiang，Tarim University，Alar843300，Xinjiang，China）

In order to optimize the enzymatic-ultrasonic continuous extraction processes of polyphenols fromwalnut green peels，the optimum extraction technology and mathematical regression model were established byresponse surface methodology on the basis of single-factor test. The results showed that the optimal extractionconditions were extraction temperature of 55 ℃， extraction time of 75.00 min， extraction pH of 5.00， enzymedosage of 15.00 U/mL， ratio of liquid to solid of 30 ∶ 1 mL/g. And the ultrasonic-assisted extraction was operatedafter enzymatic extraction for 45 min at the power of 100 W by 50 % ethanol solution as extractant. Under theseconditions， the maximum extraction yield of polyphenols from walnut green peels was 61.36 %.

response surface methodology； cellulase； ultrasonic； walnut green peels； polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.07.011

2014-11-17

新疆兵團工業(yè)科技計劃項目（NO：2012BA011）；國家級大學生創(chuàng)新項目（NO：TDGCX201246，NO：201310757009）

伏慧慧（1992—），女（漢），本科，主要研究方向：糧油加工。

*通信作者