夏大川，田軼魁，魏民新(天津市第一中心醫(yī)院，天津3009；天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

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緩激肽后處理缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3、梗死面積及細胞凋亡指數(shù)觀察

夏大川1，田軼魁2，魏民新2(1天津市第一中心醫(yī)院，天津300192；2天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

摘要：目的觀察緩激肽后處理缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3、梗死面積、細胞凋亡指數(shù)變化。方法將72只健康雄性Wistar大鼠隨機分為4組各18只，假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎；缺血再灌注(I-R)組缺血30 min，再灌注120 min。緩激肽后處理(BK)組缺血30 min，再灌注120 min，并于再灌注前予緩激肽(200 μg/kg)。BK +AG490組缺血30 min，再灌注120 min，再灌注前予緩激肽(200 μg/kg)，并于再灌注前5 min靜注AG490(3 mg/kg)。再灌注10 min時各組取6只大鼠處死，制作心肌標(biāo)本，Western blotting法檢測心肌磷酸化STAT3(p-STAT3)。再灌注120 min時將剩余大鼠處死，制作心肌標(biāo)本，TTC染色法檢測心肌梗死面積，TUNEL法計算心肌細胞凋亡指數(shù)。結(jié)果I-R組、BK組、BK+AG490組心肌p-STAT3相對表達量分別為0.28±0.04、0.56±0.08、0.27±0.05，心肌梗死面積分別為38.0%±3.0%、17.3%±2.8%、37.7%±3.8%，心肌細胞凋亡指數(shù)分別為72.0%±3.7%、40.7%±3.7%、71.7%±5.9%，BK組與I-R組、BK+AG490組比較，P均<0.01。結(jié)論 緩激肽后處理的缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3水平升高，心肌細胞凋亡指數(shù)降低，心肌梗死面積減少。

關(guān)鍵詞：缺血再灌注損傷；緩激肽；磷酸化細胞信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3

研究[1，2]表明，緩激肽后處理可模擬缺血后處理發(fā)揮心肌保護作用，且可減少對主動脈的操作，減少并發(fā)癥。JAK-STAT通路的主要作用是將細胞外信號傳遞到細胞核，進而調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)[3]，在心肌缺血再灌注損傷及內(nèi)源性心肌保護機制中發(fā)揮重要作用[4，5]。而緩激肽后處理是否可以通過激活JAK2-STAT3通路發(fā)揮心肌保護作用目前并不清楚。2013年10月，我們通過構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷模型，觀察了緩激肽后處理缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3、梗死面積、細胞凋亡指數(shù)變化。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑健康雄性Wistar大鼠72只(體質(zhì)量230～280 g)，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。緩激肽、JAK2的特異性拮抗劑AG490購自Sigma公司。TTC試劑及Western blotting檢測用β-actin、p-STAT3及t-STAT3一抗購自Cell Signaling Technology公司，二抗購自北京中杉金橋公司。TUNEL試劑盒購自羅氏公司。

1.2實驗方法

1.2.1心肌缺血再灌注損傷模型構(gòu)建、分組及處理大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mg/g)麻醉，氣管插管連接小動物呼吸機，氣源為室內(nèi)空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量13～15 mL。大鼠四肢接心電圖監(jiān)護電極。左側(cè)第四肋間開胸，以6/0無損傷線在左冠狀動脈前降支分支下約3 mm處穿一結(jié)扎線，已備結(jié)扎。結(jié)扎時采用直徑0.2 cm的細塑料管穿過結(jié)扎線用止血鉗夾緊。心電圖Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST段抬高及心肌顏色變?yōu)樯n白為結(jié)扎成功。模型建立成功后將大鼠隨機分為4組各18只，假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎；缺血再灌注(I-R)組缺血30 min，再灌注120 min。緩激肽后處理(BK)組缺血30 min，再灌注120 min，并于再灌注前給予緩激肽(200 μg/kg)。緩激肽后處理+AG490 (BK+AG490) 組缺血30 min，再灌注120 min，再灌注前給予緩激肽(200 μg/kg)，并于再灌注前5 min靜脈注射AG490(3 mg/kg)。再灌注10 min時各組取6只大鼠處死，制作心肌標(biāo)本，用以檢測心肌磷酸化細胞信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-STAT3)；于再灌注120 min時將剩余大鼠處死，制作心肌標(biāo)本，用以檢測心肌細胞凋亡指數(shù)及心肌梗死面積。

1.2.2心肌p-STAT3檢測大鼠處死后迅速取出心臟，冰生理鹽水沖凈余血，置-80 ℃冰箱快速冷凍。將速凍后的心臟自心尖向心底切成厚2 mm的切片，Western blotting法檢測p-STAT3，以β-actin作為內(nèi)參。

1.2.3心肌細胞凋亡指數(shù)測算心肌標(biāo)本固定后常規(guī)石蠟包埋和切片，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)測算心肌細胞凋亡指數(shù)。每張切片隨機取4個高倍鏡視野，計數(shù)每個高倍鏡視野下調(diào)亡細胞核數(shù)和總細胞核數(shù)。凋亡指數(shù)為100個細胞核中凋亡細胞核的個數(shù)。

1.2.4心肌梗死面積測定制作好的心肌切片置于2%TTC溶液37 ℃避光孵育30 min后，生理鹽水沖去游離染料，10%甲醛固定。藍染區(qū)為非缺血區(qū)，磚紅色區(qū)為危險區(qū)，灰白色區(qū)為梗死區(qū)。用計算機圖像分析系統(tǒng)計算左室總面積(LV)、危險區(qū)面積(AAR)及梗死面積(Infarct Size)。以AAR/LV表示心肌缺血程度，Infarct size/AAR表示心肌梗死程度。

2結(jié)果

I-R組、BK組、BK+AG490組心肌p-STAT3相對表達量分別為0.28±0.04、0.56±0.08、0.27±0.05，心肌細胞凋亡指數(shù)分別為72.0%±3.7%、40.7%±3.7%、71.7%±5.9%，心肌梗死面積分別為38.0%±3.0%、17.3%±2.8%、37.7%±3.8%， BK組與I-R組、BK+AG490組比較，P均<0.01。

3討論

細胞凋亡是一種多基因控制的自身程序性細胞死亡，可分為四個階段，第一階段是細胞凋亡信號的產(chǎn)生；第二階段是信號傳導(dǎo)；第三階段是中心控制和效應(yīng)階段；第四階段是細胞死亡階段。心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要形式之一[6]。缺血再灌注損傷作為凋亡信號，通過影響基因表達，上調(diào)再灌注后期凋亡蛋白表達致心肌細胞凋亡。Zhao等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抑制心肌細胞凋亡可明顯縮小缺血再灌注心肌梗死面積。Stat3轉(zhuǎn)錄因子是許多細胞因子和生長因子受體中重要的信號分子,它在許多人類的腫瘤細胞中持續(xù)激活,具備潛在的致癌能力和抗凋亡能力。Stat3通過705位酪氨酸磷酸化被激活，進而誘導(dǎo)它的二聚化，核定位以及DNA結(jié)合功能。STAT3的活性經(jīng)常通過能識別705位酪氨酸磷酸化的抗體來檢測。

JAK2-STAT3通路是細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，研究[8]發(fā)現(xiàn)，其在缺血預(yù)處理第二窗心肌保護機制中具有核心地位。我們前期研究[9]結(jié)果顯示，阻斷JAK2-STAT3通路后，缺血后處理減少心肌梗死面積及抗心肌細胞凋亡的作用消失，提示缺血后處理心肌保護作用依賴于JAK2-STAT3通路。

研究[1，2]證實，緩激肽后處理在多種生物模型中均可減輕缺血再灌注損傷，發(fā)揮保護作用，PI3K/Akt通路在這種保護機制中具有核心地位。以往關(guān)于緩激肽后處理心肌保護作用主要集中于其減少心肌梗死面積，而對于其抗心肌細胞凋亡的研究較少。目前緩激肽后處理抗心肌細胞凋亡的具體機制尚不十分清楚。本研究結(jié)果顯示，在活體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，緩激肽后處理不僅可減少再灌注后心肌梗死面積，而且可顯著抑制再灌注后心肌細胞凋亡。我們使用AG490阻斷JAK2-STAT3通路后，緩激肽后處理抗凋亡作用消失。提示JAK2-STAT3通路參與了緩激肽后處理抗心肌細胞凋亡機制。但緩激肽后處理是否通過JAK2-STAT3通路調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達，上調(diào)再灌注后期抗凋亡蛋白，抑制心肌細胞凋亡，還需進一步研究。

綜上所述，緩激肽后處理能減少缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積，抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用；其機制可能與JAK2-STAT3通路介導(dǎo)有關(guān)。

參考文獻：

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[9] 夏大川,田軼魁,吳志浩,等.JAK2-STAT3通路介導(dǎo)缺血后處理心肌保護作用的初步研究[J].天津醫(yī)藥,2010,38(1):43-45.

(收稿日期：2014-02-20)

通信作者：魏民新

中圖分類號：R542.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)03-0029-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.010