張艷霞，張延英，舒 暢，蔡 興，吳建軍，李存祥，康萬榮

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省分析測試中心,甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

大黃牡丹湯組方對急性胰腺炎大鼠的保護(hù)作用*

張艷霞1，張延英1，舒 暢1，蔡 興2，吳建軍1，李存祥1，康萬榮1

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省分析測試中心,甘肅 蘭州 730000)

目的：探討大黃牡丹湯組方對急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)大鼠胰腺、肝臟、腎臟功能的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。方法：取40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組(以0.1mL/min的速度，經(jīng)十二指腸壁漿肌層穿刺距離膽胰管開口0.3mm處的膽管，加壓注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)35g/L的?；悄懰徕c1μL/g)、假手術(shù)組(開腹后輕牽引、翻動胰腹、十二指腸和胰膽管)及大黃牡丹湯治療組(大黃牡丹湯 40g/kg灌胃給藥)，每組10只。造模后24h，處死各組大鼠并立即心臟取血。采用ELISA法檢測血清白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、淀粉酶含量，用生化分析儀檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總膽紅素(TBiL)含量，用免疫組化法檢測胰腺、肝臟組織核因子-κB(NF-κB)P56蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果：與模型對照組對比，大黃牡丹湯組血清IL-10含量增高，血清TNF-α含量下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，ALT、AST、TBiL、BUN、Cr降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，胰腺、肝臟組織內(nèi)NF-κBP56的表達(dá)均減少(P<0.01)。結(jié)論：大黃牡丹湯可改善AP時的胰腺、肝臟病變及肝、腎功能，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)IL-10表達(dá)、抑制NF-κBP56和TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

大黃牡丹湯/藥效學(xué)；急性胰腺炎/藥物作用；腫瘤壞死因子-α；白介素-10；NF-κBP56；動物模型；大鼠

急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是臨床常見的一種急腹癥，并發(fā)癥多[1]，死亡率高，發(fā)病過程復(fù)雜，是多種因素互相作用、互相影響的病理生理過程，具體機(jī)制至今尚不明確。近年來，隨著對細(xì)胞因子研究的深入，有學(xué)者認(rèn)識到細(xì)胞因子的過度釋放是導(dǎo)致AP病情加重的主要根源[2]，因此如何阻止炎癥細(xì)胞因子對機(jī)體的危害成為研究的主要方向。本課題考察在AP情況下大黃牡丹湯對白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)、核因子-κB(nuclearfactorκB，NF-κB)的影響及對胰腺、肝臟、腎臟等功能的影響，探索大黃牡丹湯能否對AP時的胰腺、肝臟組織起到保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2011-0001，使用許可證號為SYXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

大黃牡丹湯，由甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實驗室制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4kg/L的藥液。IL-10(批號2012102402)、TNF-α(批號2011050308)、淀粉酶試劑盒(批號20121202)及?；悄懰徕c(批號20120805)，均購自蘭州達(dá)碩生物有限公司；NF-κBP56抗體，購自SantaCruzBiotechnology公司，批號20120704。BenchmarkPlus連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；ALCYON300全自動生化分析儀，美國雅培公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與模型的建立

將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組和大黃牡丹湯組4組，每組10只。模型對照組和大黃牡丹湯組大鼠禁食、自由飲水12h后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)30g/L戊巴比妥麻醉，打開腹腔，找到膽胰管，在其近端和遠(yuǎn)端均以動脈夾或1號絲線暫時結(jié)扎，將帶有4號針頭的1mL注射器沿十二指腸壁漿肌層穿刺距離膽胰管開口0.3mm處的膽管，注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)35g/L的?；悄懰徕c1μL/g，以0.1mL/min的速度注射完畢，停留5min，去除結(jié)扎線，指壓穿刺點(diǎn)，查無漏膽，逐層關(guān)腹[3]。假手術(shù)組大鼠在開腹后僅輕輕牽引、翻動胰腺、十二指腸和胰膽管，然后關(guān)腹。所有動物術(shù)后禁食，清醒后自由飲水。

1.4 動物給藥

建立模型后立即灌胃，大黃牡丹湯組于造模后30min給予大黃牡丹湯灌胃治療1次，劑量為40g/kg(10μL/g)；正常對照組、模型對照組和假手術(shù)組灌胃等量的生理鹽水。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 血清IL-10、TNF-α

大鼠造模24h后，處死各組大鼠，并立即心臟取血，分離血清，采用ELISA法檢測血清IL-10、TNF-α、淀粉酶的含量，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 肝、腎功能

心臟取血，分離血清[4]，用生化分析儀檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總膽紅素(TBiL)含量。

1.5.3 胰腺、肝臟組織NF-κBP56

處死大鼠后迅速切取病變較為明顯的胰腺和肝臟組織，以體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛固定，石蠟包埋，免疫組化法檢測大鼠胰腺及肝臟組織中的NF-κBP56蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清IL-10、TNF-α和淀粉酶含量對比

與模型對照組對比，大黃牡丹湯組大鼠的血清IL-10含量增高，TNF-α、淀粉酶含量降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-10 、TNF-α和淀粉酶含量對比

注：與模型對照組對比，** P<0.01；與正常對照組對比，## P<0.01。

2.2 各組大鼠肝、腎功能指標(biāo)對比

與模型對照組對比，大黃牡丹湯組大鼠的血清ALT、AST、TBiL、BUN、Cr降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠肝、腎功能指標(biāo)對比

注：與模型對照組對比，** P<0.01；與正常對照組對比，# P<0.05，## P<0.01。

2.3 各組大鼠胰腺、肝臟組織NF-κBP56表達(dá)對比

與模型對照組對比，大黃牡丹湯組大鼠的胰腺、肝臟組織NF-κBP56的表達(dá)均減少，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

注：與模型對照組對比，** P<0.01；與正常對照組對比，## P<0.01。

3 討 論

急性胰腺炎無論病因如何，最終都會產(chǎn)生局部和全身炎性反應(yīng)，與炎性因子的過度生成有關(guān)[5]。參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子包括促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子[6]。多種炎性因子發(fā)生瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，引起AP炎癥擴(kuò)散，導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙以致死亡。與AP發(fā)生有關(guān)的炎性因子包括IL、TNF-α、NF-κB等，它們之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響。TNF-α是體內(nèi)重要的促炎細(xì)胞因子，由激活的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌，其升高可誘導(dǎo)IL-6、IL-8及其自身表達(dá)的增高[7]，從而引起級聯(lián)反應(yīng)造成炎癥介質(zhì)的失控性釋放；但同時機(jī)體亦存在自我清除機(jī)制，隨著時間的推移，TNF-α的含量可下降[8]。IL-10是體內(nèi)重要的抗炎細(xì)胞因子，主要由Th-2細(xì)胞產(chǎn)生，具有潛在的抗炎癥功能，能抑制IL-2、IL-3和TNF-α等細(xì)胞因子的合成，對AP所致的多器官損傷有保護(hù)作用[9]。NF-κB是以同或異二聚體形式存在的核轉(zhuǎn)錄因子[10]。NF-κB活化狀態(tài)可向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物如炎癥細(xì)胞因子參與了炎癥反應(yīng)。因此，NF-κB活化是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[11]。與AP關(guān)系較密切的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎性因子的基因啟動子都有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，因此其表達(dá)在基因水平上受到NF-κB的調(diào)控，通過抑制NF-κB可以在整體水平上減少促炎因子的表達(dá)[12]。炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制具有網(wǎng)絡(luò)性，TNF-α的產(chǎn)生受NF-κB調(diào)控，而其釋放增加又促進(jìn)NF-κB的激活，延續(xù)炎癥反應(yīng)的復(fù)雜環(huán)路調(diào)節(jié)，導(dǎo)致最初的炎癥信號不斷放大，這是一類正反饋。 在促炎因子激活的同時，IL-10等抗炎因子也被激活，抑制促炎因子的產(chǎn)生和釋放，比如IL-10可抑制NF-κB的激活，這是一類負(fù)反饋。

本研究結(jié)果表明:大黃牡丹湯可改善AP時胰腺、肝臟組織病變及肝、腎功能，其機(jī)制可能與促進(jìn)IL-10表達(dá)、抑制TNF-α及NF-κBp56蛋白表達(dá)有關(guān)。此外，與模型對照組對比，大黃牡丹湯組大鼠的血清ALT、AST、TBiL、BUN、Cr顯著減低，說明大黃牡丹湯對AP狀態(tài)下的大鼠肝臟、腎臟功能有一定的保護(hù)作用。

[1]MunsellMA,BuscagliaJM.Acutepancreatitis[J].HospMed，2010, 5(4):241-250.

[2]蘆波,錢家鳴.重癥急性胰腺炎病因及發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國實用外科雜志,2012,32(7):590-592.

[3]張馨木,孫波,李志滿,等.重組人KD/APPvar對實驗性大鼠急性壞死性胰腺炎作用的研究[J].實驗動物科學(xué),2010,27(5):66-28.

[4]高青松,劉源,張濤,等.不同類型脂肪酸對SD大鼠血清生化指標(biāo)及胰島素抵抗的影響[J].實驗動物科學(xué),2010,27(1):16-20.

[5]NormanJ.Theroleofcytokinesinthepathogenesisofacutepancreatitis[J].AmJSurg,1998,175(1):76-83.

[6]徐毅暉,陳墾,崔淑蘭,等.促炎和抗炎因子在急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2010,18(18):1912-1918.

[7]陳都,陸士奇,徐峰.急性胰腺炎繼發(fā)多器官功能障礙綜合征預(yù)測模型的建立與評價[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2012,21(8):815-818.

[8]MalleoG,MazzonE,SiriwardenaAK,etal.Roleoftumornecrosisfactor-alphainacutepancreatitis:frombiologicalbasistoclinicalevidence[J].Shock,2007, 28(2):130-140.

[9]ChenZQ,TangYQ,ZhangY,etal.Adenoviraltransferofhumaninterleukin10geneinlethalpancreatitis[J].WorldJGastroenterol,2004,10(20): 3021-3025.

[10]賴敏,何曉彬.NF-kB在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及兩者之間的關(guān)系[J].西南軍醫(yī),2010,12(4):748-750.

[11]李航,熊璟,周全榮.中藥調(diào)控核因子-kB活化的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2007, 35(2):54-56.

[12]KylnpML,RepoH,PuolakkainenPA.Inflammationandimmunosuppressioninsevereacutepancreatitis[J].WorldJGastroenterol,2010,16(23):2867-2872.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)02-0055-04

R657.5+

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.02.27

張延英，碩士，副教授，780005161@qq.com

甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項(1305TCYA043)

2014-09-11；

2014-11-04

張艷霞(1981- )，女(漢族)，甘肅白銀人,碩士，講師,主要從事新藥藥理學(xué)研究。