潘海邦，吳國(guó)泰，王 波，張志明

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州 73000 ; 2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 甘肅 蘭州 73000)

·實(shí)驗(yàn)研究·

滋腎補(bǔ)骨法對(duì)左氧氟沙星致幼鼠軟骨厚度損傷的修復(fù)作用*

潘海邦1，吳國(guó)泰1，王 波1，張志明2

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院, 甘肅 蘭州 73000 ; 2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 甘肅 蘭州 73000)

目的：探討中醫(yī)滋腎補(bǔ)骨理論對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物所致幼年機(jī)體軟骨損傷的保護(hù)作用。方法：將健康幼齡(4周齡)wistar大鼠72只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、懷牛膝組、山茱萸組、蛇床子組、懷牛膝+山茱萸、懷牛膝+蛇床子組、山茱萸+蛇床子組、懷牛膝+山茱萸+蛇床子組9組。建立左氧氟沙星誘導(dǎo)幼齡大鼠軟骨損傷模型，采用具有補(bǔ)腎功效的中藥牛膝、山茱萸和蛇床子,按L8(27)正交設(shè)計(jì)灌胃給藥，14d后取膝關(guān)節(jié)軟骨病理切片并測(cè)量軟骨厚度。結(jié)果：正常對(duì)照組軟骨厚度(190.13±12.43)μm，模型對(duì)照組(124.50±12.01)μm，中藥治療組軟骨厚度 (156.50～180.00)±(10.89～15.09)μm，各中藥治療組軟骨厚度變薄程度明顯輕于模型對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。光鏡下，各中藥及配伍組軟骨厚度亦處于正常對(duì)照組與模型對(duì)照組之間。結(jié)論：滋腎補(bǔ)骨法對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物所致幼年機(jī)體軟骨損傷具有保護(hù)作用。

滋腎補(bǔ)骨法；左氧氟沙星；軟骨厚度/保護(hù)作用；動(dòng)物模型；大鼠

喹諾酮類(lèi)藥物療效確切，交叉耐藥性相對(duì)較低，過(guò)敏反應(yīng)少見(jiàn)，加之價(jià)格低廉，是臨床常用藥物，但其對(duì)幼齡機(jī)體軟骨有損傷作用，從而導(dǎo)致該類(lèi)藥物在妊娠期、哺乳期女性及兒童中應(yīng)用受到限制。中醫(yī)常用補(bǔ)腎法治療各類(lèi)關(guān)節(jié)軟骨疾病，并取得了好的成效[1-6]，檢索常用藥物有淫羊藿、山茱萸、蛇床子、懷牛膝、補(bǔ)骨脂等，但應(yīng)用中藥防治喹諾酮類(lèi)藥物所致軟骨損傷的相關(guān)研究甚少。本研究通過(guò)正交設(shè)計(jì)探討了補(bǔ)腎中藥懷牛膝、山茱萸和蛇床子對(duì)左氧氟沙星所致幼齡大鼠軟骨損傷模型膝關(guān)節(jié)厚度的影響。

1 材料與方法

1.1 正交設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)單藥因素及其配伍，每個(gè)因素設(shè)置2個(gè)水平，按照L8(27)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組別。

表1 因素及水平表

1.2 動(dòng) 物

SPF級(jí)健康幼齡(4周齡)Wistar大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量(50.00±8.02)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0001115。自由進(jìn)食、飲水。

1.3 藥品、試劑與儀器

懷牛膝、山茱萸、蛇床子中藥材，均購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院楊錫倉(cāng)主任中藥師鑒定。三者按成人18g/d劑量給藥，等效劑量換算。劑量為1.5g/kg，容積為10μL/g，18g/60kg×10(倍)=3g；3g/10mL=150g/500mL。第1煎：將150g藥材加900mL蒸餾水，煎40min，取濾液。第2煎：藥渣加450mL蒸餾水，煎30min，取濾液。合并兩煎濾液，濃縮成500mL，按10μL/g體質(zhì)量灌胃。鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液，地奧集團(tuán)成都藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)F13051905-2。Olympus生物光學(xué)顯微鏡，產(chǎn)地日本；H.H.S21-4型電熱恒溫水浴箱， 上海醫(yī)療器械五廠產(chǎn)品；AO-82型轉(zhuǎn)輪切片機(jī)、AO-940型自動(dòng)磨刀機(jī)，產(chǎn)地美國(guó)；800型離心沉淀器，上海手術(shù)器械十廠產(chǎn)品；101型電熱恒溫干燥箱，北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠產(chǎn)品；MiE圖像系統(tǒng)，山東易創(chuàng)電子有限公司產(chǎn)品；VORTEX-5型渦旋器，購(gòu)自汕頭市澄海區(qū)立豐檢測(cè)儀器店；H1650-W型高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.4 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將72只大鼠隨機(jī)分成9組，每組8只，分別為：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、懷牛膝組、山茱萸組、蛇床子組、懷牛膝+山茱萸組、懷牛膝+蛇床子組、山茱萸+蛇床子組、懷牛膝+山茱萸+蛇床子組。造模方法參照文獻(xiàn)[7-8]方法：除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均腹腔注射鹽酸左氧氟沙星注射液40μg/g，正常對(duì)照組腹腔注射等容量的9g/L的生理鹽水，1d1次，連續(xù)21d，觀察并記錄大鼠的活動(dòng)量、皮毛色澤、飲食和排便等一般情況，每周稱(chēng)量體質(zhì)量1次。第8天開(kāi)始，除模型對(duì)照組、正常對(duì)照組外，其余各組大鼠灌胃中藥，1d1次，連續(xù)14d。中藥懷牛膝、山茱萸、蛇床子按成人18g/d劑量給藥，等效劑量換算，劑量1.5g/kg，按10μL/g體質(zhì)量灌胃。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組不給中藥。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 標(biāo)本采集

末次灌完中藥4h后，取血并脫頸椎處死大鼠，迅速剪開(kāi)膝關(guān)節(jié)處的皮膚及肌肉，暴露并剪下膝關(guān)節(jié)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)置40g/L甲醛溶液中固定；48h后以蒸餾水清洗，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)50g/L硝酸溶液脫鈣10d；將標(biāo)本以石蠟包埋，用轉(zhuǎn)輪切片機(jī)垂直于關(guān)節(jié)軟骨面將組織切片，切片厚度為8μm，然后行HE常規(guī)染色。

1.5.2 膝關(guān)節(jié)軟骨厚度

使用帶刻度Olympus顯微鏡進(jìn)行手工測(cè)量，每組隨機(jī)取3張HE染色切片(切片從脛骨外側(cè)髁切取，垂直于軟骨方向)，每張切片從最厚到最薄平均取6個(gè)不同的厚度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量從軟骨表面到鈣化層的厚度，結(jié)果用微米(μm)表示。由兩位中級(jí)以上職稱(chēng)評(píng)分者分別對(duì)切片進(jìn)行盲評(píng)，取平均值。

HE染色完畢，以中性樹(shù)膠封片，以生物光學(xué)顯微鏡在4倍、40倍下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨病理改變，并測(cè)量厚度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨厚度對(duì)比

見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨厚度對(duì)比

注：蛇床子組、懷牛膝+山茱萸組各有1只動(dòng)物不明原因死亡。

2.2 膝關(guān)節(jié)軟骨厚度正交試驗(yàn)

見(jiàn)表3。

表3 L8(27)正交試驗(yàn)表

分析：A1=124.5+160.25+123.88+181=589.63A2=180+156.75+176.13+156.5=669.38A2>A1，提示A有效。B1=124.5+160.25+180+156.75=621.5B2=123.88+181+176.13+156.5=637.51B2>B1，提示B有效。C1=124.5+123.88+180+176.13=604.51C2=160.25+181+156.75+156.5=654.5C2>C1，提示C有效。

由表4可見(jiàn)：A因素和C因素都有統(tǒng)計(jì)意義，B因素沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義，A和C的交互有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

分析A和C交互:

A1C1=124.5+123.88=248.38

表4 正交設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表

A2C1=180+176.13=356.13

A1C2=160.25+181=341.25

A2C2=156.75+156.5=313.25

可見(jiàn)A2C1最大，說(shuō)明只用A藥(懷牛膝)時(shí)軟骨厚度最大。

2.3 光鏡下膝關(guān)節(jié)軟骨厚度

正常對(duì)照組：軟骨層形態(tài)正常，切片染色均勻，組織學(xué)分層清晰，結(jié)構(gòu)正常，厚度較厚(圖1)。模型對(duì)照組：軟骨層可見(jiàn)明顯變薄，表面不規(guī)則，可見(jiàn)裂隙、中斷，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂(圖2)。各中藥及配伍組軟骨厚度處于兩者之間(圖3～6)。

圖1 正常對(duì)照組(HE，×40) 圖2 模型對(duì)照組(HE，×40) 圖3 懷牛膝組(HE，×40)

圖4 山茱萸組(HE，×40) 圖5 懷牛膝+蛇床子組(HE，×40) 圖6 蛇床子組(HE，×40)

3 討 論

喹諾酮類(lèi)藥物可致幼齡機(jī)體關(guān)節(jié)軟骨損傷，引起軟骨病理形態(tài)學(xué)改變?，F(xiàn)2010版《中國(guó)藥典》二部明確規(guī)定其為未成年人慎用或禁用藥物。有研究表明：左氧氟沙星可增強(qiáng)兔膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶細(xì)胞的凋亡，增加基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)mRNA和活化的caspase-3的表達(dá)[9]，對(duì)體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)半月板細(xì)胞具有毒性作用[10]，可致體外兔關(guān)節(jié)成纖維細(xì)胞及前十字交叉韌帶細(xì)胞明顯減少[11-12]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：軟骨損傷以腎精虧虛為主，肝血不足為次，治療當(dāng)以補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨為主，輔以補(bǔ)益氣血。現(xiàn)代藥理研究表明：補(bǔ)腎是抗衰老的一種重要手段，它可以改善微循環(huán)，防止自由基過(guò)量產(chǎn)生，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌狀態(tài)，增強(qiáng)免疫功能，保持骨量的穩(wěn)定，抑制因性激素水平下降而導(dǎo)致的骨結(jié)構(gòu)改變，使關(guān)節(jié)軟骨退變和骨端松質(zhì)骨囊腫樣變等表現(xiàn)得到明顯改善和修復(fù)[13-14]。懷牛膝性平，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行等作用。牛膝的醇提物可以增加骨小梁密度、面積、總體積及密質(zhì)骨面積，減小骨髓腔面積，阻止大鼠骨礦質(zhì)的丟失[15]。牛膝多糖能夠改善周?chē)浗M織腫脹情況，縮小關(guān)節(jié)面的變化及減輕骨贅情況的發(fā)生，增加膝關(guān)節(jié)屈伸最大角度，改善膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，從而有利于骨性關(guān)節(jié)炎的修復(fù)[16]。山茱萸具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的作用。山茱萸水提物能明顯改善SAM-P/6小鼠的骨質(zhì)疏松狀況，顯著增加骨皮質(zhì)厚度，增加SAM-P/6小鼠的抗疲勞能力，提高小鼠骨鈣、骨磷的含量，抑制骨吸收，并能明顯提高骨密度[17]。蛇床子補(bǔ)腎壯陽(yáng)，蛇床子總香豆素對(duì)使用糖皮質(zhì)激素和切除卵巢造成的骨質(zhì)疏松癥模型具有明顯治療作用[18-20]，可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能進(jìn)而起到對(duì)骨的保護(hù)作用[18]。

本實(shí)驗(yàn)采用4周齡大鼠腹腔注射左氧氟沙星40μg/g制作模型，用藥后見(jiàn)不同程度軟骨損傷，光鏡下軟骨層可見(jiàn)明顯變薄、軟骨基質(zhì)疏松、組織學(xué)分級(jí)Mankin評(píng)分增高，出現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道軟骨損傷形態(tài)改變[21-23]。軟骨厚度可作為評(píng)價(jià)軟骨損傷的一個(gè)指標(biāo)[24]。本實(shí)驗(yàn)中模型動(dòng)物組軟骨厚度較正常對(duì)照組明顯變薄，提示左氧氟沙星存在致幼年機(jī)體軟骨損傷的毒副作用。予滋腎補(bǔ)骨中藥干預(yù)后，各組軟骨厚度均較模型對(duì)照組增厚，除山茱萸組外，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明滋腎補(bǔ)骨中藥對(duì)左氧氟沙星所致軟骨損害有不同程度的保護(hù)作用。懷牛膝和蛇床子單用或配伍修復(fù)作用明顯，進(jìn)一步正交結(jié)果分析顯示，懷牛膝單用對(duì)軟骨厚度修復(fù)作用最佳。本研究所選懷牛膝、山茱萸和蛇床子均有補(bǔ)腎功效，但懷牛膝偏重活血化瘀，山茱萸偏重滋腎陰，蛇床子偏重補(bǔ)腎陽(yáng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，懷牛膝與蛇床子對(duì)軟骨損傷均有保護(hù)作用，而山茱萸無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示喹諾酮類(lèi)藥物所致軟骨損傷的病機(jī)可能更傾向于陽(yáng)虛型，故山茱萸滋陰的功效得不到較好地顯現(xiàn)。懷牛膝單用較與其他藥配伍對(duì)軟骨厚度修復(fù)作用更好，提示喹諾酮致軟骨損傷的機(jī)制可能是藥物作用于純陽(yáng)之身的幼年機(jī)體后使腎氣損傷，致腎陽(yáng)不足為主要臨床證型，進(jìn)而氣滯血瘀。另外，喹諾酮所致幼齡大鼠軟骨損害，病程一般較短，常以急性損害為主，急性損傷易致陽(yáng)氣損傷，而慢性疾病常傷陰氣，此觀點(diǎn)也支持喹諾酮所致軟骨損傷多為腎陽(yáng)虛為主要證型的推斷。本實(shí)驗(yàn)為臨床干預(yù)治療選方擇藥提供了方向。補(bǔ)腎中藥懷牛膝、蛇床子單用及配合使用對(duì)左氧氟沙星所致幼齡大鼠軟骨損傷均有效，兩藥合用效果不及單用，由此推測(cè)可能與兩種藥物中所含某些有效成分及藥物間配伍有關(guān)，此需做進(jìn)一步研究。兩藥均有溫補(bǔ)腎陽(yáng)作用，但合用效果并未加強(qiáng)，分析也可能為補(bǔ)之太過(guò)。臨證時(shí)當(dāng)考慮兩者配伍，發(fā)揮溫陽(yáng)活血功效，但需注意機(jī)體主要證候及藥物用量。本實(shí)驗(yàn)中3藥聯(lián)合運(yùn)用也未明顯增強(qiáng)治療效果，有時(shí)效果不及單藥或雙藥聯(lián)合運(yùn)用，提示：臨床辨證論治重在選藥合理，盲目增加藥物數(shù)量不一定加強(qiáng)治療作用。此外，不同比例也可能產(chǎn)生不同效果。總之，滋腎補(bǔ)骨法對(duì)喹諾酮藥物所致幼年機(jī)體軟骨損傷具有保護(hù)意義。

[1]李曉昊,鄧偉民,黃海,等.中醫(yī)藥治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,6(1):86-88.

[2]戰(zhàn)美玲,楊藝飛,張靜,等.補(bǔ)腎養(yǎng)血湯治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥療效觀察[J].甘肅中醫(yī),2007,20(2):37-38.

[3]張京松,李婉兒.中醫(yī)“補(bǔ)腎法”治療老年骨質(zhì)疏松癥臨床研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014,55(2):85-86.

[4]張國(guó)慶.中西醫(yī)結(jié)合治療老年性骨質(zhì)疏松癥的臨床療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2014,11(4):86-88.

[5]孔西建.吳丹,葉進(jìn),等.益腎活血法對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者骨密度、骨代謝及脆性骨折發(fā)生率的影響[J].中醫(yī)雜志,2014,55(5):391-395.

[6]林勇凱,黃宇新,梁桂洪.補(bǔ)腎調(diào)肝方治療高齡骨質(zhì)疏松癥伴抑郁障礙32例療效觀察[J].中醫(yī)雜志，2014，55(2):137-140.

[7]StahlmannR，KuhnerS,ShakibaeiM.Chondrotoxicityofciprofloxacininimmaturebeagledogs:immunohistochemistry,electronmicroscopyanddrugplasmaconcentrations[J].ArchToxicol,2000,73 (10/11):564-572

[8]KatoM,TakadaS,OgawaraS,etal.EffectoflevofloxacinonglycosaminoglycanandDNAsynthesisofculturedrabbitchondrocytesatconcentrationsinducingcartilagelesionsinvivo[J].AntimicrobAgentsChemother,1995,39(9):1979-1983

[9]GotoK,ImaokaM,GotoM，etal.Effectofbody-weightloadingontothearticularcartilageontheoccurrenceofquinolone-inducedchondrotoxicityinjuvenilerats[J].ToxicolLett,2013,216(2/3):124-129.

[10]WangL,WuY,TanY,etal.Cytotoxiceffectsofthequinolonelevofloxacinonrabbitmeniscuscells[J].JApplToxicol，2014,34(8):870-877.

[11]DengY,ChenB,QiY,etal.Theeffectsoflevofloxacinonrabbitanteriorcruciateligamentcellsinvitro[J].ToxicolApplPharmacol,2011,257(1):67-73.

[12]TanY,LuK,DengY,etal.Theeffectsoflevofloxacinonrabbitfibroblast-likesynoviocytesinvitro[J].ToxicolApplPharmacol， 2012,265(2):175-180.

[13]江蓉星,汪亞強(qiáng),王洪志.骨關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)藥治療[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001,24(4):11-13.

[14]高文香,劉元祿.中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎及其研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2001,25(7):335-338.

[15]高曉燕,王大為,李發(fā)美,等.牛膝中牛膝蛻皮甾酮的含量測(cè)定及促進(jìn)骨樣細(xì)胞增殖活性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2000,35(11):868.

[16]方芳鄒,來(lái)勇,湯群珍. 牛膝多糖對(duì)兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎修復(fù)的影響[J].河北中醫(yī)，2014,18(5)：749-755.

[17]崔維利,陳濤.山茱萸水提液防治骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007,18(5)：1123-1124.

[18]XieYM,QinLL,ChenJB,etal.CoumarinsfromCnidiummon-nieri(L)andtheirproliferationstimulatingactivityonosteoblast-likeUMR106cells[J].Pharmazie,2004, 59(8):643-645.

[19]胡彬,吳翠環(huán),陳璐璐.蛇床子素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞中OPG和RANKL基因mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2004,10(4):415.

[20]QinLP,ZHangQY,TianYP,etal.TotalcoumarinsfromfruitsofCnidiummonnieriinhibitformationanddifferentiationofmultinu-cleatedosteoclastsofrats[J].ActaPharmacolSin,2003, 24(2):181.

[21]HayemG,CarbonC.Areappraisalofquinolonetolerability.Theexperienceoftheirmusculoskeletaladverseeffects[J].DrugSaf, 1995, 13(6)：338-342.

[22]李萍,王永銘.喹諾酮類(lèi)藥物軟骨毒性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,2004,13(2)：116-119.

[23]魏東,李振華,張乃生.氟喹諾酮類(lèi)藥物的不良反應(yīng)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(7)：105-107.

[24]QinLP,ZHangQY,TianYP,etal.TotalcoumarinsfromfruitsofCnidiummonnieriinhibitformationanddifferentiationofmultinucleatedosteoclastsofrats[J].ActaPharmacolSin, 2003, 24(2)：181-186.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)02-0060-04

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.02.29

潘海邦(1975-)，男(漢族)，甘肅康縣人，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)及外科臨床研究。

張志明，主任醫(yī)師，zhangzhimingys@163.com

甘肅中醫(yī)學(xué)院中青年科研基金項(xiàng)目(09ZQ-19)

2014-07-24；

2014-12-04