楊其彬，何泳龍，青玉鳳，劉璐，周京國(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000;2成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細(xì)胞中ASC及其亞型的表達(dá)和意義

楊其彬1，2，何泳龍1，青玉鳳1，劉璐1，周京國1
(1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充637000;2成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床學(xué)院)

摘要:目的觀察痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(GA)患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)及其亞型(ASC-b)的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法選擇急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(AGA組)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎間歇期(IGA 組)和正常體檢者(對照組)各48例采用實(shí)時熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測PBMCs中ASC mRNA和蛋白及核因子(NF) -κB p65蛋白表達(dá)。結(jié)果AGA組ASC mRNA表達(dá)顯著高于IGA組及對照組(P均＜0.01)，IGA與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義; AGA組與IGA組ASC蛋白表達(dá)顯著低于對照組(P均＜0.01)，且IGA組最低(P＜0.01)，AGA組ASC-b蛋白表達(dá)顯著高于IGA組和對照組(P均＜0.01)，IGA組最低(P＜0.05) ; AGA組NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著高于IGA組和對照組(P均＜0.01)，IGA組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論AGA患者PBMCs中ASC及其亞型ASC-b表達(dá)異常，提示ASC及其亞型在GA的病理機(jī)制中發(fā)揮了重要功能。

關(guān)鍵詞:痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白;核因子-κB;外周血單個核細(xì)胞

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(GA)是由尿酸鹽(MSU)沉積于關(guān)節(jié)或關(guān)節(jié)旁組織而導(dǎo)致的局部炎癥，MSU通過刺激核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性體活化，募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、caspase-1形成炎性體復(fù)合物，介導(dǎo)炎癥因子IL-1β 和IL-18前體成熟和分泌。ASC是細(xì)胞內(nèi)的一種重要的連接蛋白，能夠募集上游的受體蛋白和下游的炎癥相關(guān)蛋白形成一個穩(wěn)定的蛋白復(fù)合體，即炎性體。另外，激活核因子(NF) -κB信號通路將介導(dǎo)大量炎癥因子轉(zhuǎn)錄，ASC可通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎癥因子轉(zhuǎn)錄。本研究通過檢測GA患者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中ASC及其亞型ASC-b水平，探討ASC及其亞型ASC-b在GA炎癥反應(yīng)機(jī)制中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2013年1月～2014年6月收治的GA急性期(AGA)患者48 例(AGA組)，均符合1977年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)發(fā)布的診斷標(biāo)準(zhǔn); GA間歇期(IGA)患者48 例(IGA組)，均為AGA后至少2周、血沉和CRP正常者，排除痛風(fēng)石形成、尿酸鹽腎病及尿酸性尿路結(jié)石患者。患者均為男性，AGA組年齡21～63(42.6 ±11.5)歲，病程(6.3±3.1)年; IGA組年齡18～57 (38.2±8.3)歲，病程(5.3±2.8)年。對照組為48例男性健康體檢者，年齡24～55(38.6±10.2)歲，均無痛風(fēng)家族史、心腦血管病史、感染等炎癥疾病，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無異常。三組性別、年齡具有可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ASC mRNA檢測采用實(shí)時熒光定量PCR (RT-PCR)方法。ASC及內(nèi)參β-actin基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，ASC上游: 5'-GATGCTCTGTACGGGAAGGTC-3'，下游: 5'-TCCAGTTCCAGGCTGGTGT-3'，產(chǎn)物長度115 bp;β-actin上游: 5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'，下游: 5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3'，產(chǎn)物長度128 bp。取肝素鈉抗凝外周靜脈血3 mL，人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離PBMCs，Trizol試劑提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR總體積為25 μL反應(yīng)體系: 12.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，各1 μL 10 pmol/L引物，2 μL cDNA，8.5 μL雙蒸水。反應(yīng)條件為: 95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，共40個循環(huán)。每份標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔。所有擴(kuò)增均在ABI 7900 Real-Time PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參的Ct值為ΔCt，2－ΔΔCt值表示目的基因mRNA表達(dá)水平。所有標(biāo)本均重復(fù)檢測2次取均值。

1.2.2ASC、ASC-b及NF-κB p65蛋白檢測采用Western blot方法。隨機(jī)提取AGA、IGA及對照組PBMCs總蛋白各6例，進(jìn)行BCA蛋白濃度定量，取等量蛋白上樣量，十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4℃孵育過夜(ASC、NF-κB p65、GAPDH稀釋度均為1∶1 000)，二抗室溫孵育1 h(二抗稀釋度1∶3 000)，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，使用Fusion Fx5曝光成像，Image J軟件對顯影條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，ASC/GAPDH、ASC-b/GAPDH、NF-κB p65/GAPDH灰度值作為目的蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，基因表達(dá)水平2－ΔΔCt值及蛋白水平以珋x±s表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組ASC mRNA表達(dá)AGA組、IGA組、對照組的ASC mRNA表達(dá)分別為0.027 5±0.023 9、0.022 2±0.027 7、0.017 1±0.0172 2，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01) ;進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AGA組顯著高于IGA和對照組(P＜0.05或＜0.01)，IGA組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2各組ASC及ASC-b蛋白表達(dá)AGA組、IGA組、對照組的ASC蛋白表達(dá)分別為0.72±0.22、0.45±0.09、1.87±0.21，AGA組、IGA組顯著低于對照組(P均＜0.01)，IGA組最低(P＜0.05)。AGA組、IGA組、對照組的ASC-b蛋白表達(dá)分別為2.51±0.38、0.45±0.16、0.86±0.33，AGA組顯著高于IGA組和對照組(P均＜0.01)，IGA組亦最低(P＜0.05)。

2.3各組NF-κB p65蛋白表達(dá)AGA組、IGA組、對照組的NF-κB p65蛋白表達(dá)分別為1.12±0.13、0.48±0.21、0.40±0.15，AGA組顯著高于IGA組和對照組(P均＜0.01)，IGA組高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

GA是因MSU沉積于關(guān)節(jié)或關(guān)節(jié)旁組織引起的，Martinon等［1］研究顯示，MSU能活化核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性體，介導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟和分泌，引起炎癥反應(yīng)。釋放至胞外的IL-1β通過與IL-1受體結(jié)合，激活I(lǐng)L-1信號通路和髓樣分化因子依賴的NF-κB通路，引起大量促炎因子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)［2］。由此可見，NLRP3炎性體信號通路在識別并結(jié)合MSU觸發(fā)痛風(fēng)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。

ASC作為NLRP3炎性體中重要的接頭分子蛋白，其分子結(jié)構(gòu)中含有兩個保守的結(jié)構(gòu)域，分別為熱蛋白樣結(jié)構(gòu)(PYD)和胱天蛋白募集結(jié)構(gòu)域(CARD)，這兩個結(jié)構(gòu)域都具有保守的疏水性氨基酸，并且每個結(jié)構(gòu)域都含有六個保守的α-螺旋［3］。ASC通過六α-螺旋結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)自身的寡聚化，從而募集并激活與其含有同源結(jié)構(gòu)域的其他蛋白，形成一個穩(wěn)定的蛋白復(fù)合體即炎性體，在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等信號通路中發(fā)揮重要作用［4，5］。許多上皮細(xì)胞、白細(xì)胞和外周淋巴細(xì)胞都表達(dá)ASC，但其主要在單核細(xì)胞和黏膜上皮中表達(dá)，IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-γ、TNF-α和脂多糖(LPS)可上調(diào)ASC表達(dá)［6］。Bryan等［7］報道，ASC蛋白具有三種亞型，分別為ASC-b、ASC-c和ASC-d。其中，ASC和ASC-b具有完整的PYD和CARD結(jié)構(gòu)域，能夠與NLRP3結(jié)合形成炎性體，激活下游的caspase-1，并誘導(dǎo)IL-1β等炎癥因子的釋放。

本研究采用實(shí)時定量PCR方法檢測GA患者PBMCs中ASC mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，AGA組、IGA組及對照組的ASC mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，AGA顯著高于IGA及對照組，IGA與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。表明痛風(fēng)急性發(fā)作期患者ASC基因表達(dá)顯著升高［8］，ASC在痛風(fēng)急性炎癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

ASC及其亞型ASC-b能夠與NLRP3結(jié)合形成炎性體，誘導(dǎo)炎癥因子釋放，參與炎癥反應(yīng)，而沉默ASC則會減少這些炎癥因子的產(chǎn)生和成熟［9］。ASC 與ASC-b的區(qū)別在于缺失了中間93～111位置的氨基酸即所謂的鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)能夠彎曲自我聚集，有利于NLRP3炎性體平臺的形成［10］，而缺乏鉸鏈區(qū)將削弱ASC銜接NLRP3及caspase-1的能力，減少IL-1β的成熟［3］。另有研究報道，ASC對caspase-1的活化、成熟與ASC-b相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但ASC-b促進(jìn)IL-1β的分泌顯著高于ASC［11］，說明ASC-b促進(jìn)IL-1β成熟和分泌的作用更強(qiáng)。我們發(fā)現(xiàn)，AGA及IGA組ASC表達(dá)均低于對照組，且IGA最低，而AGA組ASC-b表達(dá)顯著高于IGA及對照組，IGA組亦最低。IGA患者PBMCs中ASC及ASC-b蛋白水平顯著降低，說明ASC及其亞型通過減少NLRP3炎性體形成，抑制IL-1β的成熟和釋放，炎癥反應(yīng)減弱，病情得到緩解。

研究發(fā)現(xiàn)，ASC還參與NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)。Stchlik等［12］體外研究顯示，ASC對NF-κB信號通路具有雙重調(diào)節(jié)特性，ASC與NLRP3結(jié)合能夠?qū)е翹F-κB活化;當(dāng)僅有ASC時，其通過抑制細(xì)胞內(nèi)IκB激酶的磷酸化來抑制NF-κB活化。本研究顯示，AGA患者PBMCs中NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯高于IGA和對照組，IGA組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示ASC除參與NLRP3炎性體通路外，可能還參與活化NF-κB，引起促炎因子轉(zhuǎn)錄，參與GA的急性炎癥反應(yīng)。

綜上所述，GA患者PBMCs中ASC基因、蛋白及其蛋白亞型表達(dá)異常，ASC及其亞型可能通過影響NLRP3炎性體的形成，參與痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)過程。

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Expression and significance of ASC and its subtype in PBMCs of patients with gouty arthritis

YANG Qi-bin1，HE Yong-long，QING Yu-feng，LIU Lu，ZHOU Jing-guo
(1 Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression changes of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) and its subtype (ASC-b) in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with gouty arthritis (GA) and to investigate the clinical significance.Methods The expression levels of ASC mRNA and protein and nuclear factor (NF) -κB p65 protein in the PBMCs were detected in 48 cases of patients with acute gouty arthritis (AGA group)，48 cases of patients with gouty arthritis in the intermission (IGA group) and 48 cases of healthy controls (HC group) by using real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (PCR) and Western blotting.Results The expression of ASC mRNA in the AGA group was significantly higher than that of the IGA and HC groups (all P＜0.01)，and there was no difference between IGA and HC groups.The expression of ASC protein in the AGA and IGA groups was significantly lower than that of the HC group (all P＜0.01)，and the IGA group was the lowest (P＜0.01).The expression of ASC-b protein in the AGA group was significantly higher than that of the IGA and HC groups (all P＜0.01)，and the IGA group was the lowest (P＜0.05).The expression of NF-κB p65 protein in the AGA group was significantly higher than that of the IGA and HC groups (all P＜0.01)，and there was no statistical difference between the IGA and HC groups.Conclusion The expression of ASC and its subtype (ASC-b) in the PBMCs of patients with AGA is abnormal，which indicates that ASC and ASC-b may play a critical role in the pathogenesis of GA.

Key words:gouty arthritis; apoptosis-associated speck-like protein; nuclear factor-κB; peripheral blood mononuclear cells

(收稿日期:2015-02-03)

通信作者簡介:周京國(1963-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)樽陨砻庖咝约膊』A(chǔ)與臨床研究。E-mail: jgzhou@ nsmc.edu.cn

作者簡介:第一楊其彬(1983-)，男，博士研究生，研究方向?yàn)樽陨砻庖咝约膊』A(chǔ)與臨床研究。E-mail: yangqb_001@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272047) ;四川省教育廳科研項(xiàng)目(15ZB0202)。

文章編號:1002-266X(2015) 18-0001-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R593

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.001