魯雅雯，王 鑫，蔡明宸，梅曉丹，張 銳，朱 江，鄧仕任

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116600）

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.Var.ma-yuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟種仁,研究表明，薏苡仁油具有抗腫瘤和調(diào)整機(jī)體免疫功能的作用，其抗腫瘤的活性成分為甘油三酯類組分（TAGs）[1-3]，其中包括甘油三油酸酯，甘油三亞油酸酯等[4]。

目前，對(duì)于油脂的成分分析和質(zhì)量控制，一般是先將油脂皂化水解成相應(yīng)的脂肪酸后，再進(jìn)行檢測，但這種方法存在前處理復(fù)雜，衍生化不完全等弊端。目前，已有少數(shù)中藥材油脂提取物（如薏苡仁油脂）開始采用HPLC 法對(duì)TAGs 進(jìn)行直接測定，該方法無需水解等操作，因此具有操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。在2010 版中國藥典所收載的薏苡仁油脂的TAGs 檢測方法中，采用了HPLC 搭配蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）對(duì)其進(jìn)行含量檢測[1,5]。，但由于采用了ELSD 進(jìn)行檢測，因而該方法使用成本較高，普及率較低，一定程度上限制了其廣泛應(yīng)用?；谏鲜隹紤]，我們建立了一種基于Uv 檢測器的薏苡仁中甘油三油酸酯含量檢測方法，與ELSD 法相比，Uv 法具有使用簡便、普及率高等特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

日本島津LC-10AT 型雙泵高效液相色譜儀；SPD-10AVP 紫外檢測器；METTLERAE240 型十萬分之一分析天平（瑞士METTLER）；FA1004B 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FW-100 型高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

甘油三油酸酯對(duì)照品購自美國NU-CHEK 公司（批號(hào)：T-235-JA7-X，純度＞99%）；乙腈、正己烷、異丙醇（A.R 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），其他試劑均為分析純。

薏苡仁藥材購自全國4 個(gè)產(chǎn)地共4 批，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院初正云教授鑒定為禾本科植物薏 苡Coix lacryma -jobi L. Var.ma-yuen（Roman.）Stapf 的干燥成熟種仁。

1.2 色譜條件

色譜柱：MicrosorbC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈- 異丙醇（60∶40）；流速：1mL·min-1，檢測波長：205nm，柱溫：20℃。理論塔板數(shù)按甘油三油酸酯計(jì)算應(yīng)不低于9000。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甘油三油酸酯對(duì)照品適量，加乙腈-異丙醇- 正己烷（2∶2∶1）制成1mL 含3.0mg 的溶液，用微孔濾膜（0.45um）濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4 供試品溶液的制備

取薏苡仁粉末（過三號(hào)篩）10g，加入石油醚50-70mL，浸泡2h，超聲處理（功率80W,頻率40kHz）40min，濾過，濾液置坩堝內(nèi)水浴揮干溶劑，取出，放冷，稱重，精密稱取300.0mg 薏苡仁油于10mL 容量瓶中，用溶劑異丙醇- 乙腈- 正丁醇（2∶2∶1）定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45um）濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 線性范圍的考察

分別精密量取甘油三油酸酯對(duì)照品溶液（2.999mg·mL-1）2.0；5.0；10.0；15.0；20.0uL 注入液相色譜儀，在上述條件色譜下測定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）的（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，甘油三油酸酯的回歸為:Y=1.5×105X+81199，相關(guān)系數(shù)r=0.9993（n=5）,線性范圍為5.998～59.98μg。

1.6 精密度試驗(yàn)

取同一份薏苡仁供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6 次，以峰面積計(jì)算，甘油三油酸酯含量的精密度RSD為1.02%。

1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批薏苡仁藥材樣品6 份，按1.4 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液并測定,在1.2 項(xiàng)色譜條件下測定，按甘油三油酸酯峰面積計(jì)算，RSD=1.054%，表明本方法重復(fù)性符合分析要求。

1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取薏苡仁供試品溶液在0，2，4，6，8，12，24，48h分別進(jìn)樣測定,以峰面積計(jì)算，考察其48h 內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果甘油三油酸酯RSD=1.105%,表明樣品溶液在48h 穩(wěn)定。

1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量薏苡仁樣品9 份，3 份為一組，精密加入低、中、高濃度甘油三油酸酯對(duì)照品適量，按1.4 項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，測定峰面積以計(jì)算含量、回收率，結(jié)果平均加樣回收率100.4%，RSD=1.31%（n=9）。

1.10 樣品的含量測定

分別取不同產(chǎn)地的薏苡仁藥材粉末（過3 號(hào)篩）各10g，精密稱定，按1.4 項(xiàng)下制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算甘油三酯的含量。其色譜圖見圖1，結(jié)果見表1。

圖1 甘油三油酸酯對(duì)照品（上）及薏苡仁藥材（下）HPLC 圖譜Fig.1 HPLC of reference substance and sample of Coix seed

表1 薏苡仁中甘油三油酸酯的含量測定結(jié)果Tab.1 Determination result of triacylglycerolscontent in Coix seed

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器及檢測波長的選擇

紫外吸收檢測器不僅靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、有較好的選擇性，而且對(duì)環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成變化和流速波動(dòng)不太敏感，因此，既可用于等度洗脫，也可用于梯度洗脫。由于靈敏高，因此即使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV 檢測器進(jìn)行微量分析。由于甘油三油酸酯無長共軛基團(tuán)，特征吸收值較低，故選擇205nm 作為檢測波長。

2.2 流動(dòng)相的選擇

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，分離甘油三酯類成分現(xiàn)常采用非水反相色譜模式,經(jīng)比較了純乙腈、乙腈- 正丁醇（70∶30；V∶V）、乙腈- 甲醇（70∶30；V∶V）、乙腈-水（70∶30；V∶V）和乙腈- 異丙醇（70∶30；V∶V）等不同溶劑做流動(dòng)相的分離效果，其中以乙腈- 異丙醇（70：30；V∶V）分離效果最好，故選擇乙腈- 異丙醇做流動(dòng)相；當(dāng)乙腈- 異丙醇比例為（70∶30；V∶V），流速為1mL·min-1時(shí)，樣品各組分分離效果較好，分離度較高，但出峰時(shí)間過長；流動(dòng)相比例調(diào)整為（55∶45）流速1mL·min-1時(shí)，樣品各組分分離效果不好，分離度較低。綜合考慮出峰時(shí)間和分離效果等因素，調(diào)整流動(dòng)相比例為乙腈- 異丙醇（60∶40；V∶V）、流速1mL·min-1時(shí)取得了較好的分離效果。

2.3 柱溫的選擇

本實(shí)驗(yàn)分析的樣品為油脂類物質(zhì)，溫度對(duì)其影響較大，故考察不同溫度時(shí)樣品的分離度30℃時(shí)擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重，10℃時(shí)出峰時(shí)間較長，綜合考慮分離度和出峰時(shí)間故選用20℃。

2.4 提取方法及提油率

文獻(xiàn)表明，對(duì)于種子類藥材的提取以回流提取，索式提取，超聲提取方法等最為常用，提取溶劑以乙酸乙酯、石油醚等最為常用。實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)多次考察，最終確定提取方案為石油醚50～70mL，浸泡2h，超聲處理（功率80W，頻率40kHz）40min。經(jīng)此方法測得來自寧化、貴州、福建、云南的藥材平均含油量分別為6.99%、6.42%、6.62%、6.68%，以此數(shù)據(jù)進(jìn)行最終甘油三酯的計(jì)算。

2.5 含量測定

采用HPLC-UV 法有效地解決了薏苡仁油中甘油三酯的定性、定量分析，為薏苡仁及其油酯的分析提供了依據(jù)。含量測定結(jié)果表明四批樣品均高于2010 版中國藥典HPLC-ELSD 測定薏苡仁中甘油三油酸酯規(guī)定的含測范圍的規(guī)定，表明四批樣品質(zhì)量均上乘，且含量測定結(jié)果顯示不同種源的薏苡仁中甘油三油酸酯含量有一些差異，來自貴州產(chǎn)地和福建寧化的薏苡仁藥材樣品的含量高于其他產(chǎn)地的，結(jié)果與任江劍等含測結(jié)果一致[6]，說明由于各地種植方法和氣候條件的影響，形成了包括薏苡仁中化學(xué)成分的含量差異。

［1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010,353.

［2] 李炳生,陳秀華,任文龍.康萊特注射液的抗腫瘤作用［J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1998,29（10）:456.

［3] 陸蘊(yùn),張仲苗,章榮華.薏苡仁油抗腫瘤作用研究［J].中藥藥理與臨床,1999.

［4] 李大鵬,黃潔敏,蘇維埃,等.薏苡仁油脂的化學(xué)成分分析［J].中藥新藥與臨床藥理,1999,2（10）:99.

［5] 肖小年,薄春燕,易醒,胡少華,熊華.薏苡仁油中甘油三酯含量的快速測定［J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2011,22（4）:877-878.

［6] 任江劍，俞旭平，張斌，王志安.不同種源薏苡仁中甘油三油酸酯含量比較［J].中國現(xiàn)代中藥,2011,13（4）:15-17.