常曉雯，王 軍，孫巖峰，苗麗霞，袁海蓮，劉紅艷，李彥珊，楊新吉，張向蘭，劉秋玲，

抗原負載DC-CIK細胞治療晚期視網(wǎng)膜母細胞瘤的療效及其安全性

常曉雯1，王 軍2，孫巖峰2，苗麗霞2，袁海蓮2，劉紅艷2，李彥珊2，楊新吉3，張向蘭2，劉秋玲1，2

目的 觀察抗原負載的樹突狀細胞(dendritic cell, DC)與細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer, CIK)共培養(yǎng) (Ag-DC-CIK)細胞對晚期視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma, RB)的療效及其安全性。方法 收集武警總醫(yī)院2011-01至2014-01確診為晚期RB的26例患兒資料，其中13例采用Ag-DC-CIK細胞回輸聯(lián)合常規(guī)治療方案治療(聯(lián)合組)；其余13例僅采用常規(guī)治療方案治療(常規(guī)組)。對比分析兩組患兒資料，觀察Ag-DC-CIK細胞治療的療效及安全性。結果 聯(lián)合組患兒共接受67療程134次Ag-DC-CIK細胞治療。聯(lián)合組2例D期患兒均獲保眼機會，初診時無手術機會的4例眼外期、遠處轉移期患兒2例獲手術機會；常規(guī)組2例D期患兒均未獲保眼機會，初診時無手術機會的4例眼外期、遠處轉移期患兒僅1例獲手術機會。聯(lián)合組治療后外周血中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+T淋巴細胞比例較治療前明顯升高(均P<0.05)，CD8+T淋巴細胞比例較治療前明顯降低(P<0.05)；常規(guī)組治療前后外周血中上述細胞比例均無明顯變化。在細胞回輸過程中，僅1例次出現(xiàn)發(fā)熱，體溫37.8 ℃，未經(jīng)處理恢復正常。所有患兒的血生化、肝腎功能及心電圖在細胞治療后與常規(guī)組比較，均差異無統(tǒng)計學意義。結論 Ag-DC-CIK細胞治療晚期RB安全、有效。

細胞因子誘導的殺傷細胞；樹突狀細胞；視網(wǎng)膜母細胞瘤；化療；安全性

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是嬰幼兒時期最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤。目前，RB的治療采用以化學減容治療及局部治療為主，聯(lián)合手術、放射治療的綜合性療法。但對于晚期RB患兒，單純化學藥物治療(簡稱化療)往往難以控制病情，而局部治療又不是其適應證。而且，隨著化療時間的延長，化療的療效明顯降低，長期化療還會引起骨髓抑制、耳毒性、腎毒性等不良反應，并可能繼發(fā)第二腫瘤，大劑量化療還會導致腫瘤的多藥耐藥。因此，尋找一種安全、有效的治療方法，輔助化療及局部治療，挽救晚期患兒的生命及視力，已經(jīng)成為我國RB治療中亟待解決的問題。

近年來，以DC和CIK為基礎的腫瘤細胞免疫治療越來越多地應用于臨床。并且證實二者具有協(xié)同作用，共同培養(yǎng)后其抗腫瘤作用明顯增強[1，2]。用負載腫瘤抗原的DC與CIK(Ag-DC-CIK)細胞聯(lián)合應用，不僅能夠刺激機體產(chǎn)生針對這一抗原的細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)，特異性殺傷含有這些腫瘤抗原的腫瘤細胞，而且能增加CIK細胞的擴增數(shù)量及特異殺傷作用。目前，僅見部分Ag-DC-CIK細胞治療成人腫瘤的臨床報道[3]。筆者主要分析Ag-DC-CIK細胞治療晚期RB的療效及其安全性。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇武警總醫(yī)院2011-01至2014-01確診為晚期RB的住院患兒，共計26例。其中13例采用Ag-DC-CIK細胞回輸聯(lián)合常規(guī)治療方案治療(聯(lián)合組)；另外13例僅采用常規(guī)治療方案治療(常規(guī)組)。常規(guī)組聯(lián)合應用化療及手術治療，聯(lián)合組在常規(guī)治療基礎上加用Ag-DC-CIK細胞治療。兩組患兒的基本情況見表1。全部患兒治療前1個月均未行抗腫瘤治療且未使用免疫增強藥物，開始治療前患兒心電圖、心肌酶、肝腎功能、血常規(guī)均無明顯異常。本治療經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準，治療前均取得患兒監(jiān)護人同意并簽署知情同意書。

診斷標準：眼外期患兒根據(jù)臨床表現(xiàn)、眼眶增強核磁共振/CT診斷，眼內(nèi)期患兒尚需結合眼底檢查、眼部B超診斷，行手術治療的患兒根據(jù)術后病理確診。全部患兒進行腦脊液、骨髓細胞學、全身骨掃描檢查后明確分期。

分期標準：眼內(nèi)分期采用IIRC法[4]；術后病理顯示腫瘤已侵犯球外視神經(jīng)、篩板或CT/MRI等影像學檢查腫瘤已侵犯眼球外視為眼外期；CT/MRI檢查、腦脊液、骨髓細胞學、全身骨掃描檢查提示遠處組織或器官受累均視為遠處轉移期。分期為眼內(nèi)D期、E期、眼外期、遠處轉移期的患兒，以及復發(fā)RB患兒均視為晚期病例。疾病分期以一只眼納入統(tǒng)計，雙眼發(fā)病者以分期較重眼納入。

表1 兩組晚期視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒一般資料 (n=13)

1.2 方法

1.2.1 細胞制備 聯(lián)合組患兒依據(jù)體重于化療前1 d抽取靜脈血10～35 ml，肝素抗凝后送實驗室，無菌條件下分離并收集單個核細胞，在多種細胞因子(GM-CSF、IL-4、10%自體血漿的Alys-505)的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)擴增，按腫瘤細胞與DC比例為3∶1，加入Y79凍融抗原，第6天加入TNF-α促進DC成熟，第7天收獲Y79凍融抗致敏的成熟DC細胞，第8天收獲成熟的CIK細胞。將制備成熟的Ag-DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)(DC與CIK數(shù)量比為1∶10)，每兩天補充0.5%的自體血漿、1000 U/ml IL-2、100 ng/ml GM-CSF的Alys-505培養(yǎng)液，第5～7天收獲Ag-DC-CIK細胞備用。

1.2.2 細胞回輸 經(jīng)細菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素及細胞活性檢測合格后，于化療開始第14天靜脈隔日分2次回輸給患兒，每次回輸前30 min給予抗過敏處理，21 d為一療程。

1.2.3 常規(guī)治療方案 均應用VEC方案化療(長春新堿1.5 mg/m2,第1天；依托泊苷150 mg/m2,第1、3天；卡鉑560 mg/m2,第1天)。其中眼內(nèi)D、E期給予6～8療程化療，眼外期、遠處轉移期患兒根據(jù)病情變化延長至9～12療程。E期以上患兒根據(jù)患兒腫瘤控制情況及全身情況，行眼球摘除術或眶內(nèi)容物剜除術，術后第10天繼續(xù)常規(guī)化療。D期患兒先給予2～3周期化療觀察療效，根據(jù)病情決定眼摘或繼續(xù)保眼化療，眼摘者術后根據(jù)病理決定化療周期。

1.2.4 療效和安全性評價

1.2.4.1 D期患兒保眼情況及眼外期、遠處轉移期患兒手術情況 眼內(nèi)期患兒每周期治療前均行眼底鏡、眼部超聲檢查，每2個療程結束或臨床癥狀示疾病進展時行眼眶增強CT/MRI檢查，必要時行全身骨掃、PET/CT檢查。根據(jù)病情變化決定是否手術治療，隨訪結束時，觀察眼內(nèi)D期患兒保眼及眼外期、遠處轉移期患兒獲手術機會情況。

1.2.4.2 生存情況 通過電話長期隨訪，全部病例隨訪至2014-12-31，記錄兩組患兒的總生存期(overall survival, OS)。治療結束完全停藥后，患兒定期回院接受全面復查，明確腫瘤有無復發(fā)、轉移。復查時間為：治療結束后3個月內(nèi)每月復查1次；如無復發(fā)或進展，可延長復查時間至每3個月1次，連續(xù)3次；后延長至6個月1次，連續(xù)2次；最后延長至1年1次，總隨訪時間為5年。繪制兩組患兒的生存曲線，比較兩組患兒生存時間變化。

1.2.4.3 外周血T淋巴細胞亞群檢測 聯(lián)合組患兒治療前1 d及治療結束后1周采集外周血2 ml，以肝素抗凝后24 h內(nèi)送檢，采用流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群。

1.2.4.4 對化療耐受力的改變 觀察兩組患兒治療后外周血三系變化及惡心嘔吐發(fā)生情況。不良反應分為基本耐受及難以耐受兩級，每療程前后均進行評價，每療程中發(fā)生1次外周血三系任意一系降低或發(fā)生惡心、嘔吐即視為異常，至隨訪結束時，統(tǒng)計整個治療過程中異常情況出現(xiàn)的次數(shù)，并將兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對于外周血三系變化，基本耐受指低于正常值下限，高于需進行輸注紅細胞、血小板、注射粒細胞刺激因子的上限，其中輸注懸浮紅細胞上限為血紅蛋白低于60 g/L，輸注血小板上限為血小板低于20×109/L，注射粒細胞刺激因子上限為中性粒細胞絕對值低于0.5×109/L；難以耐受指外周血三系嚴重降低，有嚴重的貧血及發(fā)生出血、感染的可能，需輸注紅細胞、血小板、注射粒細胞刺激因子治療，并進行嚴密觀察。對于惡心嘔吐情況，基本耐受指每日惡心嘔吐次數(shù)不多于3次，可以少量進食，無水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂；難以耐受指每日惡心嘔吐次數(shù)超過3次或進食后即惡心嘔吐，隨時可能或已經(jīng)存在水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂，需補液治療并進行嚴密觀察。

1.2.4.5 安全性評價 每個療程前后均行血常規(guī)、血生化、肝腎功能及心電圖檢查。隨訪結束時統(tǒng)計其發(fā)生的次數(shù)，并進行統(tǒng)計分析。每次細胞回輸過程中監(jiān)測生命體征，每次細胞回輸前后半小時檢測體溫變化，發(fā)生不良反應隨時記錄。

2 結 果

2.1 近期療效 聯(lián)合組患兒共接受67療程134次Ag-DC-CIK細胞治療。最少2個療程，最多10個療程。回輸細胞數(shù)(5～60)×109/L，平均27.3×109/L?；剌敃r間4.0～8.5 h，平均5.8 h。

2.1.1 D期患兒保眼情況及眼外期、遠處轉移期患兒手術情況 聯(lián)合組D期2例均獲保眼機會，初診時無手術機會的4例眼外期、遠處轉移期患兒中2例獲手術機會。常規(guī)組D期2例均未獲得保眼機會，初診時無手術機會的4例眼外期、遠處轉移期患兒中僅1例獲手術機會。

2.1.2 生存情況 聯(lián)合組隨訪時間4～35個月，平均23.31個月；常規(guī)組隨訪時間10～39月，平均23.54個月。無失訪病例，聯(lián)合組中3例在隨訪過程中死亡，4例因家屬放棄治療后死亡，其余隨訪均存活。常規(guī)組中3例在隨訪過程中死亡，5例因家屬放棄治療后死亡，其余均存活。兩組患兒總生存情況見圖1，其中聯(lián)合組患兒1年生存率為92.3%；常規(guī)組為84.6%，兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.8421)。

圖1 兩組視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒生存曲線

2.1.3 治療前后T淋巴細胞亞群的改變 兩組治療前外周血中T淋巴細胞比例均無統(tǒng)計學差異。聯(lián)合組治療后外周血中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+T淋巴細胞比例較治療前升高(均P<0.05)；聯(lián)合組治療后外周血中CD8+T淋巴細胞比例較治療前明顯降低(P<0.05)；常規(guī)組治療后外周血中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD3+CD56+、CD8+T淋巴細胞比例變化均無統(tǒng)計學差異(表2)。

表2 兩組視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒治療前后外周血免疫細胞比較 (n=13；±s)

注：與治療前比較，①P<0.05；與常規(guī)組比較，②P<0.05

2.1.4 對化療耐受力改變 聯(lián)合組患兒在化療后中性粒細胞、血紅蛋白、血小板減少及惡心嘔吐情況較常規(guī)組明顯減輕，且差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05，表3)。

表3 兩組視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒化療后常見不良反應發(fā)生情況

2.2 安全性評價 聯(lián)合組患兒在細胞回輸過程中及回輸后，僅1例出現(xiàn)短暫發(fā)熱，體溫37.8 ℃，可自行降至正常，無嚴重不良反應。所有患兒的血生化、肝功能及心電圖在細胞治療后與常規(guī)組比較差異均無統(tǒng)計學意義(表4)，兩組患兒治療后均未出現(xiàn)腎功能損害。

表4 兩組患兒治療后生化及心電圖異常人數(shù)的比較 (n=13)

3 討 論

近年來，隨著治療技術的不斷發(fā)展，以化學治療聯(lián)合放療、局部治療的綜合治療方法大大改善了RB患兒的預后，使其生存率獲得了明顯提高。但是，由于長期化療存在嚴重的不良反應，隨著化療時間的延長，患兒機體耐受力降低，加之長期化療造成腫瘤多藥耐藥的發(fā)生，晚期RB患兒的預后仍然較差。

腫瘤生物治療因具有高效、低毒的特點，越來越多地受到研究者的重視[5，6]。本課題組的前期細胞水平試驗證明Ag-DC-CIK較CIK及DC-CIK對RB細胞有更好的殺瘤效果，并且其與化療具有協(xié)同作用[7，8]。目前，免疫細胞治療多用于腫瘤負荷降低后，配合常規(guī)治療方法使用，能夠有效殺滅腫瘤殘留病灶[9]。但也有研究顯示，免疫細胞治療在最初配合常規(guī)治療尤其是化療，可以改善患者的預后、提高其生存質(zhì)量、縮短化療的周期、與化療具有協(xié)同作用[10，11]。

本組資料中，聯(lián)合組D期2例患兒均獲保眼機會，初診時無手術機會的4例眼外期、遠處轉移期患兒2例獲手術機會；常規(guī)組D期2例患兒均未獲得保眼機會，初診時無手術機會的4例眼外期、遠處轉移期患兒僅1例獲手術機會。表明Ag-DC-CIK細胞治療可以為晚期患兒爭得手術機會，對于D期患兒可能提高其保眼治療的概率。

本研究中，聯(lián)合組2例在隨訪過程中死亡，3例因家屬放棄治療后死亡，8例均存活。常規(guī)組中3例死亡，4例因家屬放棄治療后死亡，6例均存活。Ag-DC-CIK細胞治療費用昂貴，家屬難以按照療程堅持治療，加之部分患兒病情加重后家屬放棄治療，造成病死率仍較高，細胞治療的療效難以完全顯現(xiàn)。其次，Ag-DC-CIK細胞為終末期細胞，對于腫瘤負荷大的晚期患者，其療效也很有限。

聯(lián)合組患兒在治療后外周血中參與免疫調(diào)節(jié)、監(jiān)視、殺傷靶細胞的CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+、CD3+CD56+T淋巴細胞比例較治療前明顯升高，而參與免疫抑制的CD8+T淋巴細胞比值明顯降低。而常規(guī)組治療前后外周血中各免疫細胞均無明顯變化。證明常規(guī)治療聯(lián)合Ag-DC-CIK細胞治療可以增強患兒的免疫功能，提高機體抗腫瘤的能力。這與成人腫瘤的研究結果相似[12]。

聯(lián)合組患兒在細胞回輸過程中及回輸后，僅1例次出現(xiàn)短暫發(fā)熱，體溫37.8 ℃，可自行降至正常，沒有發(fā)生其他嚴重不良反應。所有患兒的血生化、肝腎功能及心電圖在細胞治療后與常規(guī)組相比未見明顯變化，提示Ag-DC-CIK細胞治療安全性良好。

綜上所述，本研究將Ag-DC-CIK聯(lián)合常規(guī)治療應用于晚期RB患兒，不僅具有較好的安全性，而且有效改善了患兒的免疫功能，增強了患兒對化療的耐受能力，降低了化療的不良反應。但其所激發(fā)的免疫應答能維持多長時間，其對D期患兒保眼情況及眼外期、遠處轉移期患兒提供手術機會的概率有多大，均需要擴大樣本含量，延長觀察時間進行長期隨訪來進一步觀察總結。由于細胞治療費用昂貴，患兒及其家庭難以堅持應用，加之病例樣本較小，因此，很難判斷Ag-DC-CIK細胞治療能否改善患兒的預后。

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(2015-03-02收稿 2015-05-19修回)

(責任編輯 武建虎)

Efficacy and safety of co-cultured autologous tumor antigen-loaded dendritic cells and cytokine-induced killer cells combined with routine therapy in the treatment of advanced retinoblastoma

CHANG Xiaowen1, WANG Jun2, SUN Yanfeng2, MIAO Lixia2, YUAN Hailian2, LIU Hongyan2, LI Yanshan2, YANG Xinji3, ZHANG Xianglan2, and LIU Qiuling1, 2.

1.Graduate School of Anhui Medical University, Hefei 230032, China; 2. Department of Pediatrics, 3. Department of Orbital Disease Research Institute,the General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To evaluate the clinical efficacy and safety of co-cultured autologous tumor antigen-loaded dendritic cells (DC) and cytokine-induced killer cells (CIK) (Ag-DC-CIK) combined with routine therapy in the treatment of advanced retinoblastoma (RB). Methods 26 patients suffering from RB who were diagnosed as advanced RB in the General Hospital of the Chinese People’s Armed Police Forces between December 2011 and December 2014. 13 patients received Ag-DC-CIK combined with routine treatment (combination group). The other patients received routine therapy (routine group). Results The combination group totally received 67 cycles (134 times) Ag-DC-CIK therapy. At the end of the follow-up, all patients in combination group who suffered D got the opportunity of reserving eyes; 2 out of 4 patients who lost the opportunity of operation had surgery eventually. All the group D patients of routine group underwent enucleation. 1 out of 4 patients who lost the opportunity of operation had surgery eventually. CD3+, CD4+, CD4+/CD8+and CD3+CD56+proportion in the combination group was higher than in another group, CD8+proportion in the combination group was lower than in the routine group, and the difference was statistically significant (P<0.05). Only one patient had a fever (37.8 ℃) during the therapy, and could return to normal itself. Both groups of patients’ hepatorenal function, blood biochemistry and ECG had no statistically significant differences. Conclusions Ag-DC-CIK combined with routine therapy in the treatment of advanced RB is efficient and safe.

cytokine-induced killer cells; dendritic cells; retinoblastoma; chemotherapy; safety

首都特色臨床應用研究(Z121107001012055)

常曉雯，碩士研究生，E-mail：cxwgxdy@163.com

1.230032 合肥,安徽醫(yī)科大學研究生學院；100039 北京,武警總醫(yī)院：2.兒科，3.眼眶病研究所

劉秋玲，E-mail：wj670@vip.sina.com

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