曹義娟，徐惠，權(quán)斌，胡方方，李云鵬，楊亞茹，王潔，龐惠

[東南大學醫(yī)學院附屬徐州醫(yī)院(徐州市中心醫(yī)院)1.生殖醫(yī)學中心，2.胃腸外科，3.中心實驗室，江蘇 徐州 221009]

·論 著·

全反式維甲酸改變?nèi)巳橄侔┘毎饣|(zhì)微環(huán)境的研究

曹義娟1，徐惠1，權(quán)斌2，胡方方1，李云鵬1，楊亞茹1，王潔3，龐惠3

[東南大學醫(yī)學院附屬徐州醫(yī)院(徐州市中心醫(yī)院)1.生殖醫(yī)學中心，2.胃腸外科，3.中心實驗室，江蘇 徐州 221009]

目的：研究全反式維甲酸(ATRA)對乳腺癌細胞MCF-7增殖、分化誘導、細胞微環(huán)境改變及對乳脂球表皮生長因子8(MFGE8)轉(zhuǎn)錄表達的影響，為乳腺癌防治提供理論依據(jù)。方法：油紅O染色檢測ATRA對MCF-7細胞的分化誘導作用及對細胞微環(huán)境的影響；臺盼藍染色檢測ATRA對MCF-7細胞的增殖抑制率；實時定量PCR檢測ATRA對β-casein和對MFGE8轉(zhuǎn)錄表達的影響。結(jié)果：ATRA對MCF-7細胞有很強的分化誘導作用且呈劑量依賴性，高濃度ATRA誘導MCF-7細胞所形成的脂肪滴大于低濃度時的脂肪滴，脂肪滴主要集中于細胞膜外周及胞漿，改變了細胞微環(huán)境及形態(tài)結(jié)構(gòu)；ATRA對細胞的增殖抑制率呈劑量依賴性。 2 μmol·L-1ATRA處理細胞1～5d，第4天β-casein轉(zhuǎn)錄表達增強最為顯著，為7.26倍；第3天MFGE8轉(zhuǎn)錄表達增強最為顯著，為6.74倍。結(jié)論：ATRA誘導MCF-7細胞分化，抑制細胞生長，改變其微環(huán)境，進而促使癌細胞逆轉(zhuǎn)。

乳腺癌； 全反式維甲酸； 分化； 微環(huán)境改變； 乳脂球表皮生長因子8

全反式維甲酸(ATRA)是維生素A最重要的活性代謝產(chǎn)物。ATRA及其天然、合成的衍生物被統(tǒng)稱為視色素。視色素具有分化、抗增殖、凋亡和抗氧化特性，它們是治療和化學預防多種腫瘤(包括乳腺癌)的有前景的藥物。ATRA是第一個臨床上應用于治療急性早幼粒細胞性白血病的細胞分化藥物[1]。近年來ATRA對乳腺癌的抑制作用引起了科學家的極大關(guān)注[2]。

1997年生物學家John Dick首次報道了腫瘤干細胞(CSCs)[3]。CSCs存在于腫瘤中，可以產(chǎn)生新的腫瘤細胞，它與腫瘤的啟動、治療抵抗、腫瘤復發(fā)、血管生成和轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。近年來，科學家采用藥物分化誘導轉(zhuǎn)化CSCs為非腫瘤干細胞，清除CSCs，阻止腫瘤進一步惡化，發(fā)揮抗癌效應[4-5]。ATRA能夠分化誘導早期轉(zhuǎn)化人上皮細胞形成小管，發(fā)生形態(tài)學變化，但對高級轉(zhuǎn)化階段細胞沒有顯示任何形態(tài)學的影響；分化誘導可促使早期轉(zhuǎn)化乳腺癌細胞向正常細胞轉(zhuǎn)變，阻止其進一步惡化[6]。分化誘導所形成的脂肪滴主要集中于胞外間質(zhì)及胞漿。動態(tài)重塑細胞外基質(zhì)對轉(zhuǎn)移損傷起著重要的作用，而細胞外基質(zhì)成分的變化參與藥物對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用[7]。腫瘤細胞外環(huán)境參與腫瘤干細胞的增殖、抗氧化效應和干擾素信號傳導[8]。環(huán)境因素的改變是促使上皮腫瘤干細胞重新編程的有效途徑[9]，腫瘤微環(huán)境是腫瘤靶向藥物的重要作用靶[10]。細胞形態(tài)的改變參與細胞支架蛋白重新分布，影響細胞的粘連能力，對細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要的作用[11]。因此，分化誘導治療早期腫瘤可能具有廣闊的前景和潛力。目前尚未見關(guān)于ATRA改變?nèi)橄侔┪h(huán)境的報道。本實驗將觀察不同濃度ATRA對乳腺癌細胞MCF-7分化誘導、細胞形態(tài)的變化、微環(huán)境的改變、抑制作用及對基因轉(zhuǎn)錄表達的影響，進而重新編程癌細胞。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌雌激素受體陽性(ER+)MCF-7細胞株，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(REVCO ELITE II)，Bio-Rad iQ5 real time PCR machine。

1.3 試劑

DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、胰島素、0.25%胰酶-EDTA、ORO、Gills hematoxylin2、ATRA均購自Sigma公司。β-casein、MFGE8引物和RNAqueous-4PCR RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司。ATRA溶于DMSO，制備10 mmol·L-1儲存液，儲存于-80 ℃。

1.4 方法

1.4.1細胞培養(yǎng) MCF-7細胞用上述10% FBS-0.01 mg·ml-1胰島素DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿80%時用0.25%胰酶消化傳代。

1.4.2油紅O染色 1.24×105MCF-7對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，24 h 后換含有ATRA的新鮮培養(yǎng)基，ATRA的濃度分別為0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1。對照孔加入等體積的DMSO；3 d后換含相同濃度ATRA的新鮮培養(yǎng)基；5 d后4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗2次，用過濾過的ORO液體室溫染細胞15 min，50%酒精沖洗3次。用Gills hematoxylin2染1 min，將Gills hematoxylin2倒回瓶子，反復使用。用蒸餾水沖洗，顯微鏡下觀察。脂肪呈紅色，胞漿呈粉色，細胞核呈藍色。ATRA誘導的分化百分比：分化陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.4.3ATRA對MCF-7的生長抑制作用 MCF-7細胞接種于15 cm細胞培養(yǎng)皿，24 h后換含ATRA的新鮮培養(yǎng)基，ATRA的濃度分別為0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1。對照孔加入等體積的DMSO。3 d后換含相同濃度ATRA的新鮮培養(yǎng)基。ATRA處理細胞5 d后，用0.25%胰酶-EDTA消化細胞，用臺盼藍染色計數(shù)。ATRA對MCF-7細胞生長的抑制率=(加等體積DMSO對照孔細胞數(shù)-加ATRA孔細胞數(shù))/加等體積DMSO對照孔細胞數(shù) ×100%。實驗重復3次。

1.4.4定量PCR 按RNAqueous-4PCR(Invitrogen 公司)試劑盒說明書進行，具體步驟如下：細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，24 h后加入ATRA至最終濃度2 μmol·L-1，藥物處理細胞共5d，中間第3天換含2 μmol·L-1ATRA的新鮮培養(yǎng)基，吸去培養(yǎng)基，加入500 μl裂解液，用刮刀收集細胞于EP管中。充分振蕩，13 000 r·min-1離心3 min。將上清轉(zhuǎn)移至新EP 管，加500 μl 64%酒精振蕩混勻，將混合液移至過濾柱內(nèi)，13 000 r·min-1離心1min，700 μl洗液#1洗柱子，用500 μl 洗液#2/3洗柱子2次，13 000 r·min-1離心30 s。將柱子置于新EP管上，用50 μl 80℃洗脫液洗脫柱子2次，離心30 s。加入0.1倍體積的10×DNaseI緩沖液、1 μl DNaseI，37 ℃ 30 min。加入0.1倍體積DNase失活試劑，放置2 min。加入0.1倍體積5 mol· L-1醋酸胺、0.02倍體積丙烯酰胺、2.5倍體積100%酒精，置于-20℃過夜。13 000 r·min-1離心30min，棄上清，用70%酒精洗RNA 2次，40 μl洗脫液溶解RNA。取適量RNA 稀釋至100 μl，在紫外分光光度計上測定OD260 nm和OD280 nm。樣品總RNA(μg·μl-1)=OD260 nm×稀釋倍數(shù)/25。OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0為樣品較純。反轉(zhuǎn)錄反應：總RNA 2 μg，Random hexamers 1 μl，10 mmol·L-1dNTP 1 μl，加nuclease-Free蒸餾水至12 μl，70 ℃ 10 min，冰浴。5×First-Strand Buffer 4 μl，0.1 mol·L-1DTT 2 μl，RNaseOUT 1 μl，混勻，室溫 10 min，SuperscriptII 1 μl，42 ℃ 45 min，50 ℃ 15 min，70 ℃ 15 min，冰浴。-80 ℃保存?zhèn)溆?。通過Primer3軟件設計引物。GAPDH作為看家基因。用SYBR Green試劑合擴增45個循環(huán)。根據(jù)CT值，算出相對表達值。實驗重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 ATRA對MCF-7細胞的分化誘導作用

ATRA對MCF-7細胞的分化誘導作用如圖1、2所示。不同濃度ATRA處理MCF-7細胞5d，油紅O染色測定MCF-7分化陽性細胞。結(jié)果顯示，高濃度ATRA(5、2 μmol·L-1)引起細胞外基質(zhì)形成大的脂肪塊，在胞漿內(nèi)形成小的脂肪滴；當ATRA 1 μmol·L-1以下時，在胞漿及細胞外基質(zhì)形成小的脂肪滴(Lipid droplet)。0、0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1ATRA引起MCF-7細胞分化百分比分別為2.1%、8.5%、26.3%、31.6%、40.8%、65.3%。其分化誘導陽性百分比對ATRA呈劑量依賴性關(guān)系。

2.2 ATRA對MCF-7細胞的生長抑制作用

ATRA對MCF-7細胞的生長抑制作用如圖3所示。ATRA在0、0.08、0.4、1、2及5 μmol·L-1時，細胞總數(shù)分別為1.24×107、1.22×107、1.20×107、1.09×107、0.99×107、0.71×107。 ATRA對MCF-7細胞生長的抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系，抑制率分別為(1.58±1.1)%、(3.21±0.77)%、(12.9±0.47)%、(20.18±2.6)%及(42.76±1.6)%。

2.3 2 μmol·L-1 ATRA對β-casein和MFGE8轉(zhuǎn)錄表達的影響

2 μmol·L-1ATRA對β-casein和MFGE8轉(zhuǎn)錄表達的影響如圖4所示。β-casein是MCF-7細胞分化標志物。定量RT-PCR結(jié)果顯示，2 μmol·L-1ATRA處理細胞1～5d，β-casein轉(zhuǎn)錄活性相對于DMSO對照組分別增強了(0.92±0.16)、(2.49±0.10)、(2.41±0.15)、(7.26±0.58)、(5.82±0.36)倍。此結(jié)果表明ATRA對MCF-7細胞具有顯著分化誘導作用，在第4天其分化誘導作用最為顯著，第5天次之。2d 后ATRA顯著增強 MFGE8的轉(zhuǎn)錄表達。第1～5天MFGE8轉(zhuǎn)錄活性與DMSO對照組相比分別增強了0.29(0.29±0.26)、1.25(1.25±0.30)、6.74(6.74±1.55)、4.64(4.64±0.88)及2.40(2.40±0.59)倍，其中第3天增強最為顯著。

3 討 論

乳腺癌是威脅婦女身體健康的主要疾病，其中約有70%乳腺癌是ER+乳腺癌。藥物誘導分化治療被認為可能是根除腫瘤干細胞的有前景的治療方法之一。本實驗用ATRA處理ER+乳腺癌細胞株MCF-7 5d，當ATRA高濃度(5、2 μmol·L-1)時，在細胞膜外周及胞漿內(nèi)所形成的脂肪滴聚集成大的脂肪塊；當ATRA 1 μmol·L-1以下時，在細胞膜外周及胞漿內(nèi)形成小的脂肪滴(lipid droplet)。ATRA對MCF-7細胞的分化誘導作用呈劑量依賴性。如圖1所示，ATRA改變了MCF-7細胞形態(tài)學結(jié)構(gòu)及微環(huán)境。微環(huán)境的改變可以重新編碼乳腺癌程序[12]。十多年前科學家提出了組織結(jié)構(gòu)領(lǐng)域理論(tissue organization field theory，TOFT)。此理論認為，腫瘤是一個可以逆轉(zhuǎn)的過程，腫瘤細胞與周圍環(huán)境之間相互作用的改變可以逆轉(zhuǎn)腫瘤表現(xiàn)型。這種相互作用對腫瘤的起始、發(fā)展、基因表達、分化、凋亡過程起著重要作用。如圖3所示，ATRA對MCF-7生長的抑制作用呈劑量依賴性，這與文獻[6]報道的1、10 μmol·L-1ATRA抑制細胞生長和改變細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的結(jié)果相吻合。

圖1 不同濃度ATRA對MCF-7細胞的分化誘導作用(×40)

圖2 不同濃度ATRA引起MCF-7細胞分化誘導百分比

牛奶蛋白基因的表達水平反映了上皮細胞的分化能力[13]，β-casein是主要牛奶蛋白，是乳腺上皮細胞分

圖3 ATRA對MCF-7細胞的抑制作用

化標志物[14]。圖4表明2 μmol·L-1ATRA處理MCF-7細胞1～5d，β-casein的轉(zhuǎn)錄表達在5d內(nèi)均顯著增強，第4天分化誘導作用最為顯著，其mRNA表達提高了7.26倍，第5天次之，提高了5.82倍，此結(jié)果與油紅O染色脂肪滴測定結(jié)果相吻合，均表明ATRA是ER+乳腺癌MCF-7細胞強分化誘導藥物，可能具有廣闊的乳腺癌治療潛力。MFGE8對維持上皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進黏膜愈合起著重要作用，其表達隨ER+乳腺癌病情發(fā)展而下調(diào)，其轉(zhuǎn)錄表達微弱減少能夠增強ER+乳腺癌增殖，此基因是乳腺癌標志物和治療靶[15]。本實驗(圖4)顯示2 μmol·L-1ATRA處理MCF-7細胞1～5d，2d 后MFGE8表達顯著上調(diào)，3d 后MFGE8轉(zhuǎn)錄表達最為顯著，與DMSO對照組相比增強6.74倍，此結(jié)果表明ATRA能夠促進MFGE8表達恢復和逆轉(zhuǎn)，這對抑制MCF-7癌細胞的生長起著重要的作用。 ATRA改變MCF-7胞外基質(zhì)微環(huán)境和顯著增強β-casein、MFGE8的轉(zhuǎn)錄表達，在PubMed中均未見報道。本研究揭示ATRA誘導MCF-7細胞分化，抑制其生長，改變胞外基質(zhì)微環(huán)境，進而促使乳腺癌細胞重新編程和逆轉(zhuǎn)，為乳腺癌防治提供理論依據(jù)。

圖4 2 μmol·L-1ATRA對β-casein及MFGE8轉(zhuǎn)率表達的影響

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The study of microenvironment modification of extracellular matrix in breast cancer by all-trans retinoic acid

CAO Yi-juan1，XU Hui1，QUAN Bin2，HU Fang-fang1，LI Yun-peng1，YANG Ya-ru1，WANG Jie3，PANG Hui3

(1.ReproductiveCentre; 2.GastrointestinalSurgeryDivision; 3.LaboratoryCentre，XuzhouCentralHospital，theAffiliatedXuzhouHospitalofMedicalSchoolofSoutheastUniversity，Xuzhou221009，China)

Objective: This study was designed to investigate the effects of ATRA on the proliferation，differentiation，microenvironment and MFGE8 transcription of breast cancer cells (MCF-7)，which will provide theoretical basis for breast cancer therapy. Methods: Oil red O staining was used to estimate the differentiation induction and microenvironment modification of MCF-7 by ATRA. The inhibitory effect of ATRA on MCF-7 was determined by trpan blue exclusion. The effect of ATRA on ?-casein and MFGE8 transcription was demonstrated by real time PCR. Results: MCF-7 differentiation was obviously induced by ATRA in a dose-dependent manner. Lipid droplets induced by high concentrations of ATRA were much larger in size than that induced by low concentrations. Lipid droplets located in cytoplasm and outside of cell membranes modified the microenvironment and the cell structure. The inhibition rates of cell proliferation by different concentrations of ATRA were in a dose-dependent manner. After MCF-7 treatment with 2μmol·L-1ATRA for 1 to 5 days，β-casein transcription increased most by 7.26-fold on the fifth day. In the meantime，MFGE8 transcription increased most by 6.74-fold on the third day. Conclusion: ATRA exerts the effects on the proliferation，differentiation and microenvironment of MCF-7 cells，which can be further reprogrammed and reversed.

breast cancer； all-trans retinoic acid； differentiation，microenvironment； milk fat globule EGF factor Ⅷ

2015-06-19

2015-08-25

曹義娟(1974-)，女，江蘇徐州人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士。E-mail:xzjj2002@126.com

權(quán)斌 E-mail:1472164106@qq.com

曹義娟，徐惠，權(quán)斌，等.全反式維甲酸改變?nèi)巳橄侔┘毎饣|(zhì)微環(huán)境的研究[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2015，34(6)：992-996.

R737.9

A

1671-6264(2015)06-0992-05

10.3969/j.issn.1671-6264. 2015. 06．030