趙 靜，王宏偉，田二杰，周變?nèi)A

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003）

蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）就是從整體水平上來(lái)認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的存在及活動(dòng)方式（表達(dá)、修飾、功能、相互作用等），從而更好的闡明生命科學(xué)本質(zhì)的學(xué)科［1］。蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，囊括了由一個(gè)細(xì)胞乃至一個(gè)機(jī)體的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)［2］。通過(guò)將病理個(gè)體或處理樣本與對(duì)照樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組比較分析，可以找到差異表達(dá)蛋白分子及其信號(hào)通路，進(jìn)而為揭示生命本質(zhì)、疾病的早期診斷和新藥設(shè)計(jì)提供分子標(biāo)志。蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的成熟和發(fā)展使這門(mén)學(xué)科得到了不斷的進(jìn)步和完善，不僅為探索生命奧秘提供了理論和技術(shù)支持，并且為闡明疾病機(jī)理、保障人和動(dòng)物健康提供了理論根據(jù)和解決途徑［3］。

1 雙向電泳技術(shù)

1.1 雙向電泳技術(shù)的原理

雙向電泳（two－dimensional electrophoresis，2－DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的重要分離分析手段，能夠提高細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分離的分辨率，并反映機(jī)體的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及轉(zhuǎn)譯后的修飾狀況［4］。經(jīng)典雙向電泳由Klose和O＇Farell在1975年建立，該技術(shù)首先根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使蛋白質(zhì)在載體兩性電解質(zhì)（carrier ampholytes，CA）pH 梯度膠中進(jìn)行等電聚焦，然后按照分子量大小在SDS－PAGE中進(jìn)行第二向分離。電泳后的樣品可進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、銀染、熒光染料染色等不同方法染色，一般認(rèn)為，銀染比考馬斯亮藍(lán)染色的靈敏度高，但后者價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好，與膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜鑒定兼容性好，所以仍然是實(shí)驗(yàn)室最常用的染色方法。使用熒光染料的靈敏度與銀染相當(dāng)，對(duì)質(zhì)譜的干擾較小，但需要配備昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。獲得處理好的凝膠后，存儲(chǔ)凝膠圖像獲取完整的蛋白定性和定量信息，依靠圖像分析軟件來(lái)完成蛋白質(zhì)各種信息的分析。

1.2 雙向電泳技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用

2－DE具有簡(jiǎn)便、快速、高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也有自動(dòng)化程度低，重復(fù)性差，以及對(duì)過(guò)大和過(guò)小分子量的蛋白質(zhì)、低豐度蛋白質(zhì)、極酸或極堿和難溶的蛋白質(zhì)如膜蛋白等分離困難的缺點(diǎn)。固相pH梯度的凝膠電泳的建立和完善，克服了以前使用CA的不足，使電泳技術(shù)的加樣量、重復(fù)性有了明顯改善，并進(jìn)一步提高了疏水蛋白、低豐度蛋白及堿性蛋白的分辨率［5］。

一直以來(lái)，傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)無(wú)法對(duì)兩個(gè)蛋白質(zhì)樣品的差異進(jìn)行檢測(cè)與定量，因而不能應(yīng)用于大規(guī)模的蛋白組學(xué)分析，但差異凝膠電泳技術(shù)的建立與使用卻彌補(bǔ)了這一缺陷。差異凝膠電泳是對(duì)2－DE在技術(shù)上的改進(jìn)，結(jié)合多重?zé)晒夥治龅姆椒ǎ梅肿恿肯嗥ヅ涞牟煌瑹晒馊玖蠘?biāo)記兩個(gè)蛋白樣品，再取等量混合后進(jìn)行內(nèi)標(biāo)，最后進(jìn)行雙向電泳，通過(guò)檢測(cè)凝膠上的不同熒光而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品間差異的檢測(cè)。該方法靈敏度精確性較高，增加了不同樣品因生物學(xué)變化而導(dǎo)致差異的可信度。現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，使雙向電泳技術(shù)可以與包括質(zhì)譜技術(shù)在內(nèi)的新方法聯(lián)用，已在細(xì)菌［6］、植物［7］、昆蟲(chóng)［8］等生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，尤其是在與人類疾病相關(guān)的蛋白組研究中，例如Luczak M等［9］利用2－DE和質(zhì)譜技術(shù)（mass－spectrograph，MS）技術(shù)發(fā)現(xiàn)了急性粒細(xì)胞白血病未分化型／部分分化型（AML－M1／M2）患者與健康對(duì)照者之間的25種差異蛋白，并提出了可能為急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）潛在的生物標(biāo)志物的5種蛋白質(zhì)。

2 免疫共沉淀技術(shù)

2.1 免疫共沉淀技術(shù)的原理

免疫共沉淀（co－immunoprecipitation）是蛋白組學(xué)中用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典方法。該技術(shù)以抗體和抗原之間的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，不僅能夠確定生理?xiàng)l件下細(xì)胞或組織內(nèi)2種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否存在相互作用，還可以探究與已知相互作用的蛋白［10］。它的基本原理是在非變性條件下裂解細(xì)胞，保留細(xì)胞內(nèi)存在的相互作用蛋白質(zhì)，將目的蛋白的抗體加入細(xì)胞裂解液中，使目的蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白沉淀下來(lái)。經(jīng)過(guò)洗脫，收集沉淀物并進(jìn)行分離，最后對(duì)分離所獲的蛋白進(jìn)行鑒定。該方法所研究的蛋白均是在體內(nèi)經(jīng)過(guò)翻譯后修飾的，并且是可分離的天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物，能夠反映正常生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)間的相互作用。

2.2 免疫共沉淀技術(shù)的的特點(diǎn)及應(yīng)用

免疫共沉淀技術(shù)主要用于緊密結(jié)合的相互作用蛋白質(zhì)研究，對(duì)于瞬時(shí)或低親和力的相互作用蛋白研究相對(duì)較少。其原因是目的蛋白質(zhì)只有達(dá)到一定的濃度才能與抗體結(jié)合形成復(fù)合體沉淀，而且要求復(fù)合體在一系列的清洗過(guò)程中應(yīng)保持不變，所以該方法僅適用于從細(xì)胞中溶解出來(lái)后仍為生理復(fù)合體的蛋白質(zhì)。Zolotnik I A等［11］就利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（suppressor of cytokine signaling－3，SOCS－3）與胰島素受體β亞單位（insulin receptorβ－subunit，IR－β）和 SOCS－3與胰島素受體底物－1（insulin receptor substrate 1，IRS－1）的相互作用的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致IR－β與IRS－1的相互作用減弱，而這可能是磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3－K）在 肥 胖Zucker鼠骨骼肌中活性降低的原因。此外，將免疫共沉淀技術(shù)與雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用研究，能夠獲得更加廣泛和準(zhǔn)確的信息。

3 酵母雙雜交系統(tǒng)

3.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理

酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two－h(huán)ybrid system）是一種較為簡(jiǎn)便、靈敏和高效的，在酵母體內(nèi)分析蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的基因系統(tǒng)，由Fields和Song等在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中提出建立。該系統(tǒng)利用真核細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（binding domain，BD）識(shí)別DNA上的特異序列并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）啟動(dòng)所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄這一原理，將已知蛋白X和待研究蛋白Y的基因分別與編碼AD和BD的序列結(jié)合，通過(guò)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，生成兩個(gè)融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，則AD和BD在空間上接近就能形成完整的有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，表達(dá)相應(yīng)的報(bào)告基因；反之，如果X和Y之間不存在相互作用，報(bào)告基因就不會(huì)表達(dá)。這樣，通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)與否，便可確定是否發(fā)生了蛋白質(zhì)的相互作用。

3.2 酵母雙雜交技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用

該方法在研究蛋白質(zhì)相互作用方面具有諸多優(yōu)點(diǎn)：①酵母雙雜交雜交系統(tǒng)以生長(zhǎng)速度較快的酵母作為報(bào)道菌株，具有轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)單、效率較高的特點(diǎn)，而且對(duì)許多微弱或短暫的蛋白質(zhì)相互作用具有較高的敏感度，可借助報(bào)告基因在表達(dá)過(guò)程中的多級(jí)放大效應(yīng)反映出來(lái)；②因融合蛋白之間的相互作用在真核酵母活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，這樣蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)翻譯后修飾，可能保持天然的空間構(gòu)象和折疊狀態(tài)，更接近細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況，多種營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記易于篩選，使試驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)可靠。但是該技術(shù)也存在許多問(wèn)題，例如依賴于翻譯后修飾的蛋白質(zhì)相互作用一般不適用此方法，因?yàn)榧せ顖?bào)告基因的相互作用的蛋白質(zhì)必須定位于核內(nèi)，而且假陽(yáng)性及假陰性問(wèn)題也不可忽視。

為了對(duì)這種技術(shù)進(jìn)行比較和優(yōu)化，Caufield J H等［12］做了一系列試驗(yàn)，證明3次酵母雙雜交法就可以檢測(cè)出一組標(biāo)準(zhǔn)互作蛋白集的78%，而進(jìn)行第4次檢測(cè)更是可以將結(jié)果提升到83%，說(shuō)明多次酵母雙雜交試驗(yàn)足以檢測(cè)出系統(tǒng)中大部分相互作用蛋白。該方法目前在蛋白質(zhì)相互研究中應(yīng)用廣泛，不僅可以檢驗(yàn)已知蛋白質(zhì)之間的相互作用甚至微弱短暫的作用，還可以從cDNA文庫(kù)中篩選靶蛋白的相互作用蛋白。通過(guò)建立蛋白相互作用圖譜，可用于確定基因治療中多肽類藥物的作用靶點(diǎn)［13－16］。酵母雙雜交系統(tǒng)的許多相關(guān)研究方法與技術(shù)也已得到了改進(jìn)和完善，目前以衍生出單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)、核外雙雜交系統(tǒng)、反向雙雜交系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)等，為蛋白質(zhì)組研究提供了豐富的技術(shù)平臺(tái)。

4 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

4.1 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)原理

蛋白質(zhì)芯片是一種新型的生物芯片，能夠進(jìn)行高通量的蛋白功能分析。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)是蛋白探針在固相支持物（載體）表面的大規(guī)模集成，利用樣品中標(biāo)記或未經(jīng)標(biāo)記的靶蛋白分子與探針進(jìn)行反應(yīng)，然后通過(guò)熒光法、放射性同位素法或無(wú)標(biāo)記檢測(cè)法等相應(yīng)的方法進(jìn)行檢測(cè)，最后由計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，獲得高豐度表達(dá)蛋白。

4.2 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用

蛋白質(zhì)芯片的特異性強(qiáng)，敏感性高，并且具有高通量、重復(fù)性好、應(yīng)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，也面臨著一些挑戰(zhàn)，例如需要大量的蛋白質(zhì)探針，且探針蛋白的空間結(jié)構(gòu)和活性影響著蛋白質(zhì)芯片的穩(wěn)定性和保質(zhì)期，檢測(cè)的特異性也受到相似蛋白在交叉配對(duì)上的影響。

目前，蛋白質(zhì)芯片反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)包括多種方法，其中熒光標(biāo)記技術(shù)成熟、簡(jiǎn)便、安全，靈敏度能滿足絕大多數(shù)需求，放射性同位素標(biāo)記也是傳統(tǒng)檢測(cè)中常用的手段之一，但SELDI－TOF－MS（表面加強(qiáng)激光解吸離子化－飛行時(shí)間質(zhì)譜法）技術(shù)作為直接檢測(cè)法的無(wú)標(biāo)記模式，在蛋白質(zhì)天然活性檢測(cè)方面有著特別的優(yōu)勢(shì)，成為了生命科學(xué)領(lǐng)域中蛋白質(zhì)組學(xué)研究 的 有力工具［17－18］。Zhao L 等［19］通 過(guò) SELDITOF－MS與蛋白質(zhì)芯片聯(lián)用技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在低、中、高砷暴露組中的血清中存在20種差異顯著蛋白，并且高砷組與低砷組之間的差異蛋白明顯多于高砷組與中砷組之間的差異蛋白，在蛋白組水平上證實(shí)了砷的毒性作用，為該技術(shù)在環(huán)境毒理學(xué)中應(yīng)用提供了思路。

5 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)

5.1 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)原理

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在2004年推出的一項(xiàng)體外同位素標(biāo)記技術(shù)，可以同時(shí)使用8種（或4種）不同的同位素試劑來(lái)標(biāo)記和比較8種（或4種）不同的蛋白質(zhì)樣品。這些試劑分別由質(zhì)量為113、114、115、116、117、118、119 和 121 的 報(bào) 道 基 團(tuán) （reporter group），質(zhì)量為192、191、190、189、188、187、186和184的平衡基團(tuán)（balance group）和1個(gè)相同的肽反應(yīng)基團(tuán)（reactive group）組成。一般過(guò)程是將樣品經(jīng)胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解為肽段后與iTRAQ試劑多重標(biāo)簽進(jìn)行差異標(biāo)記，使試劑的肽反應(yīng)基團(tuán)與樣品肽段的N端及賴氨酸側(cè)鏈連接，標(biāo)記所有酶解肽段。將標(biāo)記樣本相混合，最后用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS／MS）進(jìn)行分析。由于平衡部分保證iTRAQ試劑標(biāo)記的同一肽段的質(zhì)荷比相同，因此不同同位素標(biāo)記的同一多肽在第一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)質(zhì)荷比完全相同，而在串聯(lián)質(zhì)譜中，標(biāo)記肽段裂解，使平衡基團(tuán)在二級(jí)質(zhì)譜發(fā)生中性丟失，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比（113～121）的峰，根據(jù)波峰的高度及面積，通過(guò)生物信息學(xué)的工具和分析方法得到蛋白質(zhì)的定量信息。

5.2 iTRAQ技術(shù)的特點(diǎn)及應(yīng)用

該技術(shù)作為一項(xiàng)新的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，在應(yīng)用中具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可同時(shí)對(duì)8種或4種樣本進(jìn)行定量比較，省時(shí)省力；②能夠標(biāo)記樣本中幾乎所有的蛋白質(zhì)，包括DIGE技術(shù)不能檢測(cè)的膜蛋白、疏水蛋白等及翻譯后修飾的蛋白；③報(bào)告離子為小分子物質(zhì)，能保證定量的準(zhǔn)確性。但其缺點(diǎn)在于iTRAQ試劑也容易與樣本中的雜質(zhì)蛋白及樣本處理中緩沖液的污染蛋白結(jié)合，因此需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，盡量減少污染。另外，iTRAQ試劑非常昂貴［20］。

目前，iTRAQ技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究中得到了廣泛的應(yīng)用。在微生物研究中，Manavalan A等［21］使用iTRAQ技術(shù)研究了白腐菌生長(zhǎng)于纖維素、木質(zhì)素及其兩者混合物中時(shí)分泌蛋白酶的不同，為木質(zhì)纖維素生物能源的利用提供了理論基礎(chǔ)；在關(guān)于分子機(jī)制的相關(guān)研究中，F(xiàn)erret－Bernard S等［22］分別分析了未成熟、促Th1分化和促Th2分化的DC細(xì)胞膜表面蛋白的變化，為DC細(xì)胞促進(jìn)Th1和Th2分化的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解；同時(shí)，該技術(shù)也更多地運(yùn)用在了生物標(biāo)志蛋白的發(fā)現(xiàn)研究中，揭示了各類疾病潛在的致病機(jī)理［23－25］。

iTRAQ作為一種新型的蛋白組學(xué)技術(shù)，完美的將非凝膠串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種不同樣本同時(shí)進(jìn)行定量分析的愿景。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，iTRAQ具有較好的定量效果和良好的重復(fù)性。隨著該技術(shù)的深入開(kāi)展及質(zhì)譜技術(shù)、軟件分析系統(tǒng)的改進(jìn)，iTRAQ必將成為定量蛋白組學(xué)的支撐技術(shù)。

6 小結(jié)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要性使其相關(guān)技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。其中，雙向電泳作為分離分析蛋白質(zhì)的重要手段，在蛋白質(zhì)組研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但基于質(zhì)譜的iTRAQ技術(shù)很好的解決了雙向電泳在極端蛋白分離、自動(dòng)化高通量等方面的弊端，成為蛋白組學(xué)研究的主要工具之一。免疫共沉淀、酵母雙雜交及蛋白質(zhì)芯片等研究蛋白質(zhì)相互作用的方法在試驗(yàn)中各有其優(yōu)缺點(diǎn)，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果，所以同時(shí)選擇兩種以上的研究方法進(jìn)行研究結(jié)果的驗(yàn)證是十分必要的?？傊?，這些技術(shù)被廣泛地應(yīng)用在各個(gè)科學(xué)領(lǐng)域，并通過(guò)現(xiàn)有研究方法和技術(shù)的改進(jìn)、不同方法和技術(shù)的結(jié)合使用及新技術(shù)的發(fā)明不斷完善生命活動(dòng)中的蛋白質(zhì)時(shí)空互作網(wǎng)絡(luò)，為生命科學(xué)研究帶來(lái)了更多的成果［26］。

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