劉雨田，孫成友，遲田英，肖衛(wèi)華，王志亮＊

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.江西省遂川縣畜牧獸醫(yī)局，江西遂川 343906）

牛海綿狀腦?。˙ovine spongiform encephalopathy，BSE）又稱瘋牛病，是由朊病毒引起的牛的漸進(jìn)性致死性傳染病，與羊癢病、鹿慢性消耗性疾病以及人克－雅氏癥等統(tǒng)稱為傳染性海綿狀腦?。═ransmissible spongiform encephalopathy，TSE）［1］。瘋牛病為人畜共患病，病原主要通過(guò)消化道途徑感染人。1986年，英國(guó)報(bào)道了全球第1例BSE，2年后英國(guó)查明BSE是由于牛飼用了污染癢病因子（即羊源性朊病毒）的肉骨粉而引起［2］。依據(jù)這個(gè)調(diào)查結(jié)果，各BSE發(fā)生國(guó)陸續(xù)實(shí)施反芻動(dòng)物源性肉骨粉不得飼喂反芻動(dòng)物以及剔除特定風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)等綜合防控措施，隨后全球BSE病例數(shù)急劇下降，疫情得到很好控制，防控措施取得巨大成功。學(xué)術(shù)界在2003年以前普遍認(rèn)為全球的BSE是由癢病因子（羊源性朊病毒）引起，因此樂(lè)觀估計(jì)只要牛不飼喂動(dòng)物源性飼料，全球消滅BSE指日可待。然而，在2003年，日本和意大利首次分別報(bào)道了1例和2例與典型BSE（C型BSE）不同但又類似的病例，稱之為非典型BSE［3］。初步研究發(fā)現(xiàn)非典型BSE的致病因子雖然也是朊病毒，但與C型BSE的病原存在分子質(zhì)量、糖基化、腦部分布等方面的差異［4－5］。此后，又有多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道類似病例，并且有國(guó)家通過(guò)追溯查到早在2001年就已出現(xiàn)非典型BSE［6］。截止2013年底，全球的非典型BSE數(shù)量已超過(guò)60例，遍布十幾個(gè)國(guó)家，但主要還是分布于本土BSE發(fā)生國(guó)。非典型BSE病例的不斷發(fā)現(xiàn)引起世界各國(guó)和相關(guān)國(guó)際組織的高度關(guān)注，給全球BSE的防控又提出了新的挑戰(zhàn)。本文對(duì)非典型BSE的特征和特點(diǎn)進(jìn)行了概述，旨在提高人們對(duì)非典型BSE的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為完善我國(guó)BSE的防控工作提供理論支持。

1 基本特點(diǎn)

根據(jù)朊病毒的蛋白酶K抗性部分分子質(zhì)量大小，非典型BSE可以分為H型BSE（朊病毒分子質(zhì)量比C型BSE的較重）和L型BSE（朊病毒分子質(zhì)量比C型BSE的較輕）。不管是黃牛品種，還是瘤牛品種，均發(fā)現(xiàn)了非典型BSE病例［7］。據(jù)目前有限的非典型BSE病例分析，發(fā)病牛平均年齡約為11歲，是C型BSE平均年齡的2倍［8］。H型和L型BSE的病例數(shù)比例大約呈1∶1的關(guān)系［4］。至于非典型BSE的基因突變問(wèn)題，僅見(jiàn)報(bào)道美國(guó)H型BSE病例存在病毒第211號(hào)密碼子的E／K突變性［9］，然而在其他H型BSE病例中未發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)的突變性［10］。針對(duì)非典型BSE，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織專門召集相關(guān)專家進(jìn)行過(guò)兩次討論，認(rèn)為非典型BSE是一個(gè)變種，具有自發(fā)性散發(fā)性特點(diǎn)，發(fā)病率低，約為1／1 000 000～3／1 000 000，并且當(dāng)前的BSE防控措施仍然有效，無(wú)需改變?；谝陨嫌^點(diǎn)，每個(gè)養(yǎng)牛國(guó)家均有可能會(huì)出現(xiàn)非典型BSE病例，只是能不能發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題。

2 臨床癥狀與病理變化

非典型BSE沒(méi)有特征性的臨床癥狀。2007年，法國(guó)研究人員對(duì)35例非典型BSE的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，18例為臨床健康牛，其余17例為死?；蛴胁《痹椎呐?，其中4頭死牛在死亡前表現(xiàn)為倒地不起，3頭急宰牛臨床表現(xiàn)為C型BSE的神經(jīng)性癥狀［8］。腦部接種H型BSE腦勻漿液的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種牛9個(gè)月后表現(xiàn)出精神萎靡，異常低頭，耳朵下垂，食欲下降，體況變差。隨著病程發(fā)展，病牛離群，頭抵住墻或門，連短暫的抬頭也不情愿。病牛開(kāi)始舔唇部，異常咀嚼（與進(jìn)食無(wú)關(guān)），后期它們的頻率和嚴(yán)重程度進(jìn)一步加重，同時(shí)可見(jiàn)過(guò)度流涎［9］。在另一組腦內(nèi)接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H型和L型BSE發(fā)病牛的臨床癥狀沒(méi)有差別，均表現(xiàn)出與C型BSE相似的神經(jīng)癥狀，如消沉、焦躁不安、驚恐、感覺(jué)過(guò)敏。此外，發(fā)病牛站立困難，步態(tài)異常，后肢過(guò)度伸展［11］。與C型BSE相似，非典型BSE也沒(méi)有解剖病變。通過(guò)蘇木精伊紅染色，H型和L型BSE均可見(jiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)空泡變性。在腦閂部，C型BSE的空泡化明顯比非典型BSE的嚴(yán)重。然而，在大腦部，非典型BSE（包括H型和L型）的空泡化比C型BSE的嚴(yán)重，尤其在額葉皮質(zhì)［11］。也有接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H型BSE在丘腦部核群和中腦部的空泡化最為嚴(yán)重，而在大腦皮層、小腦、基底核則呈中等程度的空泡化［10］。

3 病原在機(jī)體中的分布

腦內(nèi)接種試驗(yàn)表明，非典型BSE的病原在腦部分布明顯比C型BSE的要均勻，而且總體上L型BSE的腦部病原密度比H型BSE的要濃些［5］。H型BSE的病原廣泛分布于腦部、脊髓和視網(wǎng)膜，少量分布于腦垂體神經(jīng)部和三叉神經(jīng)節(jié)，其中病原含量最多的部分是在腦干和丘腦，而小腦、嗅球、大腦皮層僅見(jiàn)少許病原［5，9］。H型BSE在下神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)、星狀神經(jīng)節(jié)、交感神經(jīng)干、面神經(jīng)、坐骨神經(jīng)、視神經(jīng)、副神經(jīng)、臂神經(jīng)叢、迷走神經(jīng)、脊神經(jīng)、馬尾和腎上腺等神經(jīng)組織也能檢測(cè)到病原［10］。L型BSE的病原在腦干、基底核、嗅腦和丘腦含量最高，在大腦皮層和小腦部的含量次高，僅比腦干部（包括腦閂）的含量略低點(diǎn)［5，12］。研究還發(fā)現(xiàn)［13］，在臨床前期，L型BSE感染牛的幾個(gè)主要神經(jīng)節(jié)（包括三叉神經(jīng)節(jié)、頸部神經(jīng)節(jié)、腸系膜神經(jīng)節(jié)、星狀神經(jīng)節(jié)）、腦垂體、馬尾（脊髓末端）、迷走神經(jīng)和迷走交感干均可以檢測(cè)到病原。在臨床后期，腎上腺、前肢神經(jīng)（包括肩胛上神經(jīng)、臂神經(jīng)叢、正中神經(jīng)、橈神經(jīng)）、坐骨神經(jīng)、脛神經(jīng)、膈神經(jīng)和副神經(jīng)也能檢測(cè)到病原。然而，兩種非典型BSE的淋巴組織均未發(fā)現(xiàn)病原［10］。

4 病原分子和生化特征

在溫和工作濃度（50μL／mL）的蛋白酶K（proteinase K，PK）處理60min（37℃）后，用抗朊病毒核心片段單克隆抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)L型BSE病原的雙糖基化、單糖基化和無(wú)糖基化3條蛋白帶的組成比例分別為39.3%±0.6%、35.0%±1.0%和26.3%±1.2%，分子質(zhì)量大小分別為26.3ku±0.6ku、20.7ku±0.6ku和17.3ku±0.6ku，3條蛋白帶的分子質(zhì)量均比C型BSE病原的對(duì)應(yīng)條帶小1個(gè)ku左右。而H型BSE病原的雙糖基化、單糖基化和無(wú)糖基化蛋白帶的組成比例與C型BSE的類似，分別為58.3%±2.5%、29.3% ±0.6%和12.7% ±3.5%，分子質(zhì)量大小分別為28.7ku±1.5ku、23.3ku±1.2ku和19.3ku±1.2ku，3條蛋白帶的分子質(zhì)量比C型BSE的對(duì)應(yīng)條帶均大1.5個(gè)ku左右［4］。因牛的個(gè)體差異、單抗的不同或PK酶處理的差異，其他研究結(jié)果與上述數(shù)據(jù)相比略有不同，但總體上一致［5，10］。將 PK 酶作用時(shí)間延長(zhǎng)（工作濃度為50μL／mL）或?qū)⑵涔ぷ鳚舛忍岣叩?50μL／mL及以上進(jìn)行處理，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C型BSE病原對(duì)PK酶的抵抗性最強(qiáng)，L型BSE的次之，H型BSE的最弱［4－5］。用 N－糖酰胺酶F（一種去糖基化酶）處理后，發(fā)現(xiàn)L型BSE的病原對(duì)該酶最敏感，糖基化的去除也最為完全，而H型BSE的次之，C型BSE的最不敏感。應(yīng)用抗朊病毒C端抗體檢測(cè)，還發(fā)現(xiàn)H型BSE多了一條10ku大小的條帶，而L型和C型BSE的則沒(méi)有［4，10］。試驗(yàn)表明，抗朊病毒N端抗體僅能檢測(cè)到H型BSE的3條蛋白帶，而對(duì)于C型和L型BSE，要么信號(hào)很弱，要么檢測(cè)不到。用抗朊病毒核心片段或C端抗體則可以檢測(cè)到所有類型BSE的3條蛋白帶［4］。另外，H型和L型BSE的病原均能在腦部如大腦白質(zhì)、基底核和丘腦等處形成淀粉樣斑塊［10］，而 C型 BSE沒(méi)有這種特征［3］。

5 傳染性

目前證實(shí)，人工條件下L型BSE病原可以感染家牛［14］、綿羊［15］、倉(cāng)鼠［16］、獼猴［17］、狐猴［18］、野生型小鼠（第一代接種不發(fā)病，呈亞臨床感染狀態(tài)，第2代接種才感染發(fā)?。?9］、表達(dá)人朊蛋白［20］和牛朊蛋白［21］的轉(zhuǎn)基因小鼠。而關(guān)于H型BSE的感染性試驗(yàn)報(bào)道較少，就現(xiàn)有資料表明，H型BSE病原可以感染家牛［14］、表達(dá)牛朊蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠［21］、野生型小鼠（第一代接種就感染發(fā)?。?2］。在感染表達(dá)人朊蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L型BSE的感染率比C型BSE的明顯高，達(dá)到100%，而H型BSE不能使小鼠發(fā)病，感染率為0［20］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與C型BSE（平均潛伏期為230d）比較，L型BSE感染表達(dá)牛朊蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的潛伏期明顯縮短（平均潛伏期為185d），而H型BSE的潛伏期明顯延長(zhǎng)（平均潛伏期為330d）［21］。目前數(shù)據(jù)提示L型BSE比C型BSE具有更強(qiáng)的傳染性。

6 診斷方法

不管是L型還是H型BSE，其病原在腦閂部的含量均較高，因此C型BSE的檢測(cè)手段（采集腦閂部組織進(jìn)行檢測(cè)）也適合于非典型BSE。應(yīng)用各種類型BSE的病料進(jìn)行試驗(yàn)，比較目前常用的BSE快速篩檢方法敏感性，發(fā)現(xiàn)Idexx HerdChek BSEScrapie短型方法具有最高的敏感性，其次是AJ Roboscreen BetaPrion方法、PrionScreen Check Western方法和Idexx HerdChek BSE－Scrapie超短型方法［23］。它們的敏感性均達(dá)到歐盟的相關(guān)要求。在非典型BSE確診方面，一般應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫印跡方法，因此只要選用公認(rèn)的針對(duì)朊病毒核心片段的單抗如6H4、P4、L42、F99等，就可以對(duì)非典型BSE做出確診。

7 小結(jié)

幾年來(lái)，在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）報(bào)告的BSE病例中，非典型BSE越來(lái)越多，C型BSE越來(lái)越少。這一現(xiàn)象說(shuō)明，全球BSE疫情發(fā)生了質(zhì)的變化，由過(guò)去的肉骨粉引起B(yǎng)SE疫情轉(zhuǎn)變成自發(fā)性BSE病例。然而，非典型BSE與C型BSE一樣具有較強(qiáng)的感染性，尤其是L型BSE，對(duì)多種動(dòng)物均有較強(qiáng)致病性。因此，國(guó)際上對(duì)非典型BSE不敢一絲怠慢，仍然堅(jiān)持嚴(yán)格的飼料禁令，美國(guó)更是在2009年加強(qiáng)了動(dòng)物飼料禁令。另外，歐盟、北美等發(fā)生瘋牛病的地區(qū)仍然嚴(yán)格執(zhí)行以風(fēng)險(xiǎn)為基礎(chǔ)的監(jiān)測(cè)，強(qiáng)調(diào)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)臨床疑似、死亡和緊急屠宰的牛，歐盟還對(duì)年齡大于72月齡的健康牛也進(jìn)行監(jiān)測(cè)。相信這些措施的繼續(xù)實(shí)施，今后會(huì)有更多的非典型BSE病例出現(xiàn)，同時(shí)也將非典型BSE帶來(lái)的新挑戰(zhàn)化成不可怕的普通動(dòng)物疫病事件。既然非典型BSE是一種老年牛的自發(fā)性疫病，那么不管哪個(gè)國(guó)家都應(yīng)加強(qiáng)防范，努力防止人畜感染。目前，人們對(duì)非典型BSE的認(rèn)識(shí)還非常有限，還不清楚它到底怎么來(lái)的、與什么因素相關(guān)、病原間的關(guān)系、病原在牛體內(nèi)何時(shí)才出現(xiàn)等問(wèn)題還需要解答。

［1］Prusiner S B.Prions［J］.Proc Natl Acad Sci，1998，95：13363－13383.

［2］Wilesmith J W，Wells G A，Cranwell M P，et al.Bovine spongiform encephalopathy：epidemiological studies［J］.Vet Rec，1988，123（25）：638－644.

［3］Casalone C，Zanusso G，Acutis P，et al.Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy：molecular similarities with sporadic Creutzfeldt－Jakob disease［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（9）：3065－3070.

［4］Dudas S，Yang J，Graham C，et al.Molecular，biochemical and genetic characteristics of BSE in Canada［J］.PLoS One，2010，5（5）：e10638.

［5］Priemer G，Balkema－Buschmann A，Hills B，et al.Biochemical characteristics and PrP distribution pattern in the brains of cattle experimentally challenged with H－type and L－type atypical BSE［J］.PLoS One，2013，8（6）：e67599.

［6］Morignat E，Vulin J，Calavas D，et al.Atypical bovine spongiform encephalopathies，F(xiàn)rance，2001－2007［J］.Emerg Infect Dis，2008，14（2）：298－300.

［7］Tester S，Juillerat V，Doherr M G，et al.Biochemical typing of pathological prion protein in aging cattle with BSE［J］.Virol J，2009，6：64.

［8］Ducrot C，Arnold M，de Koeijer A，et al.Review on the epidemiology and dynamics of BSE epidemics［J］.Vet Res，2008，39（4）：15.

［9］Greenlee J J，Smith J D，West Greenlee M H，et al.Clinical and pathologic features of H－type bovine spongiform encephalopathy associated with E211Kprion protein polymorphism［J］.PLoS One，2012，7（6）：e38678.

［10］Okada H，Iwamaru Y，Imamura M，et al.Experimental H－type bovine spongiform encephalopathy characterized by plaques and glial－and stellate－type prion protein deposits［J］.Vet Res，2011，42：79.

［11］Konold T，Bone G E，Clifford D，et al.Experimental H－type and L－type bovine spongiform encephalopathy in cattle：observation of two clinical syndromes and diagnostic challenges［J］.BMC Vet Res，2012，8：22.

［12］Polak M P，Zmudzinski J F.Distribution of a pathological form of prion protein in the brainstem and cerebellum in classical and atypical cases of bovine spongiform encephalopathy［J］.Vet J，2012，191（1）：128－130.

［13］Iwamaru Y，Imamura M，Matsuura Y，et al.Accumulation of L－type bovine prions in peripheral nerve tissues［J］.Emerg Infect Dis，2010，16（7）：1151－1154.

［14］Balkema－Buschmann A，Ziegler U，McIntyre L，et al.Experimental challenge of cattle with German atypical bovine spongiform encephalopathy（BSE）isolates［J］.J Toxicol Environ Health Part A，2011，74（2－4）：103－109.

［15］Matsuura Y，Iwamaru Y，Masujin K，et al.Distribution of abnormal prion protein in a sheep affected with L－type bovine spongiform encephalopathy［J］.J Comp Pathol，2013，149（1）：113－118.

［16］Shu Y，Masujin K，Okada H，et al.Characterization of Syrian hamster adapted prions derived from L－type and C－type bovine spongiform encephalopathies［J］.Prion，2011，5 （2）：103－108.

［17］Comoy E E，Casalone C，Lescoutra－Etchegaray N，et al.A－typical BSE （BASE）transmitted from asymptomatic aging cattle to a primate［J］.PLoS One，2008，3（8）：e3017.

［18］Mestre－Frances N，Nicot S，Rouland S，et al.Oral transmission of L－type bovine spongiform encephalopathy in primate model［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（1）：142－145.

［19］Capobianco R，Casalone C，Suardi S，et al.Conversion of the BASE prion strain into the BSE strain：the origin of BSE？［J］.PLoS Pathog，2007，3（3）：e31.

［20］Beringue V，Herzog L，Reine F，et al.Transmission of atypical bovine prions to mice transgenic for human prion protein［J］.Emerg Infect Dis，2008，14（12）：1898－1901.

［21］Buschmann A，Gretzschel A，Biacabe A G，et al.Atypical BSE in Germany－proof of transmissibility and biochemical characterization［J］.Vet Microbiol，2006，117（2－4）：103－116.

［22］Baron T，Vulin J，Biacabe A G，et al.Emergence of classical BSE strain properties during serial passages of H－BSE in wildtype mice［J］.PLoS One，2011，6（1）：e15839.

［23］Meloni D，Davidse A，Langeveld J P，et al.EU－approved rapid tests for bovine spongiform encephalopathy detect atypical forms：a study for their sensitivities［J］.PLoS One，2012，7（9）：e43133.