劉 暢,敖威華,李 磊,于立新,么宏強,周建華,馬學(xué)恩
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;3.安徽科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,安徽鳳陽 233100;4.內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心,內(nèi)蒙古呼和浩特 010020;5.哈藥集團生物疫苗有限公司,黑龍江哈爾濱 150001)
綿羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis,OPA)的病原是綿羊肺腺瘤病毒 (OPAV)。OPAV是典型的β逆轉(zhuǎn)錄病毒,其基因組成僅包含逆轉(zhuǎn)錄病毒必要的結(jié)構(gòu)基因gag、pro、pol和env,同時在病毒基因的兩端還各包含一個病毒復(fù)制不可缺少的非編碼區(qū),即長末端重復(fù)序列(long terminal repeat,LTR)。OPA多發(fā)生于綿羊,在歐洲、非洲、美洲及亞洲都有流行,幾乎所有養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)都有該病的存在,對于養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展,特別是種羊業(yè)具有重大影響,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為必須通報的動物疫病。本文就當(dāng)前OPAV的轉(zhuǎn)錄特異性、受體及其囊膜蛋白等相關(guān)致瘤機制的研究進行綜述。
OPAV在逆轉(zhuǎn)錄病毒中具有獨特的性質(zhì),能夠惡性轉(zhuǎn)化肺Ⅱ型上皮細胞和無纖毛細支氣管細胞(克拉拉細胞,Clara cells)。有研究表明,在由肺Ⅱ型上皮細胞和克拉拉細胞衍生的細胞系(MLE-15和mtCC1-2)中,OPAV LTR具有較強的轉(zhuǎn)錄活性[1-2]。單獨表達 OPAV 囊膜蛋白(Env)可誘導(dǎo)鼠成纖維細胞系NIH 3T3轉(zhuǎn)化。LTR在某些逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化細胞中起重要作用,但OPAV的LTR卻沒有該誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化能力[3]。OPAV LTR的U3序列中包含2個與肺特異基因表達有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子——肝細胞胞核因子3(HNF-3/Fox-a2)結(jié)合位點。在NIH 3T3細胞中表達的外源 HNF-3能夠增強OPAV LTR的轉(zhuǎn)錄活性,提示LTR的轉(zhuǎn)錄特異性決定了 OPAV 對肺組織的趨向性[1-2]。
在OPAV LTR中與CATT/增強子結(jié)合蛋白(CATT/enhane linding protein,C/EBP)和轉(zhuǎn)錄因子核因子(nuclear factor1,NF-1)亞型相結(jié)合的2個額外基序顯示出其對于LTR活性來說是非常重要的[2]。缺失突變 OPAV LTR 與轉(zhuǎn)錄因子C/EBP﹑HNF-3β的結(jié)合位點使得該LTR在肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)的啟動子活性下降約60%~70%,說明這兩個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點對OPAV LTR在肺Ⅱ型上皮細胞內(nèi)的特殊嗜性具有重要作用[4]。而OPAV LTR中對宿主轉(zhuǎn)錄因子Gfi-Ⅰ的結(jié)合位點對該LTR在肺Ⅱ型上皮細胞內(nèi)的啟動子活性卻幾乎沒有影響[4]。
研究表明,OPAV 受體為 Hyal-2(hyaluronoglucosaminidase 2)。Hyal-2蛋白通過糖基磷脂酰肌醇(glyocsyl phosphatidyl inositol,GPI)與細胞膜相連,是一種GPI錨定蛋白。Hyal-2具有透明質(zhì)酸酶活性,可通過裂解胞膜透明質(zhì)酸影響OPAV的致瘤作用。由于Hyal-2為GPI錨定蛋白,因此還可通過GPI對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生影響。此外,該蛋白還具有一些目前尚未明確的生物學(xué)功能(例如促進綿羊胎盤形態(tài)發(fā)生)[5]。同時,Hyal-2還是地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(enzootic nasal tumorvirus,ENTV)和內(nèi)源性O(shè)PAV(enOPAV)的受體。OPAV Env的表面蛋白亞基(SU)能夠與綿羊 Hyal-2相結(jié)合,其中su基因的238bp~867bp域?qū)@種結(jié)合是必須的[6]。
OPAV受體Hyal-2蛋白結(jié)合于生長因子Stk/RON受體,形成Hyal2-RON復(fù)合體,具有低酪氨酸激酶受體家族成員(recepteur d'origine nantais,RON)激酶活性。當(dāng)存在OPAV Env時,Env能夠替換Hyal-2而釋放出RON,結(jié)果增加了激酶的活性。這些細胞RON活化后便激活了PI3K/Akt和MAPK這兩條通路[7]。雖然OPAV Env能夠轉(zhuǎn)化嚙齒動物成纖維細胞,但是OPAV Env的SU亞基卻不能與鼠源Hyal-2受體相結(jié)合。并且,過表達鼠Hyal-2對OPAV Env轉(zhuǎn)化NIH 3T3細胞沒有影響。另外,Stk/RON在成纖維細胞中不表達。然而,在表達人Hyal-2和綿羊Hyal-2的NIH 3T3細胞中,OPAV Env的轉(zhuǎn)化能力卻受到了明顯的抑制,這可能是通過促進Env的降解而起作用的[3,8]。
為研究OPAV的促腫瘤形成機制,曾有人嘗試證明OPAV可能攜帶癌基因,并通過研究OPAV基因組能否從形態(tài)學(xué)上轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)的細胞來證明該假說。巨細胞病毒(cytomegaovirus,CMV)啟動子調(diào)控的OPAV21表達質(zhì)??捎糜跈z測OPAV基因組的轉(zhuǎn)化可能性。在NIH 3T3細胞中,OPAV LTR的轉(zhuǎn)錄活性很低,而將OPAV21DNA轉(zhuǎn)染進入該細胞后,發(fā)現(xiàn)這些細胞呈轉(zhuǎn)化聚積表現(xiàn),并且該聚積區(qū)域內(nèi)檢測出 OPAV 的 DNA[9]。這表明OPAV包含可能轉(zhuǎn)化NIH 3T3細胞的基因,同時這也強烈地提示OPAV攜帶有致癌基因。后期的試驗證明了OPAV env基因單獨表達對于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化NIH 3T3細胞是必須和充分的[9]。OPAV Env的致癌能力在體內(nèi)也已被證明過了[10]。將OPAV Env第501位亮氨酸/纈氨酸是OPAV在pH5.0下進行膜融合及感染所必須的[11]。
OPAV Env的穿膜蛋白亞基橫跨病毒囊膜脂質(zhì)雙分子層,包含有一個長度為44個氨基酸的C末端區(qū)域。Env很有可能在感染或轉(zhuǎn)化細胞中起到重要的作用。Env的胞質(zhì)尾區(qū)包含有YRNM序列,即“YXXM”基序;如果其中的酪氨酸是磷酸化的,則該序列可能的作用是PI3K/p85調(diào)節(jié)亞基的一個結(jié)合位點[12]。
OPAV Env在不同培養(yǎng)條件下、對不同細胞系的轉(zhuǎn)化作用可能有所不同[13]。env基因經(jīng)位點刪除和置換突變后進行轉(zhuǎn)化試驗,結(jié)果顯示TM的胞質(zhì)C末端區(qū)域?qū)τ贠PAV Env轉(zhuǎn)化能力是必不可少的[14]。TM胞質(zhì)尾部中的“YXXM”基序是很保守的,但在非轉(zhuǎn)化型的enOPAV中卻是缺失的。這與OPAV Env激活質(zhì)膜PI3K的形式相一致,被激活的PI3K對Akt以及下游信號途徑發(fā)出指令,即PI3K/Akt通路密切參與細胞增殖。
將“YXXM”基序中的酪氨酸殘基點突變?yōu)楸奖彼峄蛱於彼岷?,Env失去了轉(zhuǎn)化NIH 3T3細胞的能力[14]。不過在其他細胞系中,這種轉(zhuǎn)化抑制卻不是絕對的。同樣地,“YXXM”基序中的甲硫氨酸殘基(M)突變也可以導(dǎo)致其OPAV Env失去轉(zhuǎn)化NIH 3T3細胞的能力,而在其他細胞系中這種效應(yīng)也不是一定的[14]。雖然 TM 的胞質(zhì)尾區(qū)對于OPAV轉(zhuǎn)化是重要的,Env其他區(qū)域也有可能同樣參與了OPAV的轉(zhuǎn)化。有研究表明,在OPAV Env誘導(dǎo)NIH 3T3細胞轉(zhuǎn)化并激活A(yù)kt的過程中,其TM亞基起到了主要作用,并且TM亞基還具有單獨誘導(dǎo)NIH 3T3細胞轉(zhuǎn)化的能力[3]。此外,在SU糖蛋白中小片段的缺失或插入也可以抑制OPAV Env轉(zhuǎn)化NIH 3T3和208F成纖維細胞,SU的氨基末端區(qū)域有利于轉(zhuǎn)化,而C-末端部分是不重要的[15]。OPAV Env的SU亞基具有調(diào)節(jié)其局部結(jié)構(gòu)的功能,通過受體介導(dǎo)由低pH激活的膜融合[16]。因此,在OPAV Env誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中,細胞轉(zhuǎn)化信號可能是由SU和TM亞基分別提供的[3]。
在OPAV轉(zhuǎn)化的幾個細胞系中都能夠檢測到含量較高的磷酸化 Akt[3,9],同樣的在 OPA腫瘤組織中也可以檢測到[12]。此外,細胞感染OPAV后,PI3K-Akt通路的激活劑也能夠使細胞Akt信號通路發(fā)生調(diào)節(jié)異常。采用PI3K的抑制劑——渥曼青霉素和LY294002處理細胞,結(jié)果OPAV誘導(dǎo)Akt磷酸化的能力被高度抑制[9,12],這顯示了在這些細胞中發(fā)生了PI3K依賴性的Akt激活。OPAV Env的TM胞漿尾部“YXXM”基序的Y590磷酸化且該基序的酪氨酸殘基突變,這些都不能完全廢除其轉(zhuǎn)化這些細胞系的能力[12,15]。盡管 OPAV Env轉(zhuǎn)化能力有所降低,但是OPAV“YXXM”基序突變卻也不能完全阻止 Akt磷酸化[12,15]。這或許是 OPAV Env通過尚未明確的細胞受體或由OPAV Env所觸發(fā)的其他信號通道間接地激活了PI3K/Akt信號通路。此外,OPAV能夠誘導(dǎo)缺乏PI3K/p85亞基的NIH 3T3細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,并且在轉(zhuǎn)化細胞中Akt被激活,這說明PI3K不是OPAV誘導(dǎo)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化所必需的[12]。因此,研究者普遍認為,無論是否依賴PI3K,激活A(yù)kt是OPAV Env介導(dǎo)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的分子標(biāo)志[15]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的抑制劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA),可以局部抑制Env的轉(zhuǎn)化率,這顯示出mTOR與OPAV Env誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 NIH 3T3細胞有關(guān)[12]。
在綿羊的基因組中存在與OPAV前病毒基因組高度相關(guān)的多個內(nèi)源性拷貝[17-18],因此在研究OPAV致瘤機制時必須將enOPAV和外源性O(shè)PAV(exOPAV)的基因序列進行區(qū)別[19]。exOPAV區(qū)別于enOPAV的典型分子特征,包括其ex-OPAV gag基因中的ScaⅠ酶切位點,核衣殼蛋白區(qū)2個保守的可形成鋅指結(jié)構(gòu)的“CCHC”基序和env基因編碼的TM區(qū)胞漿尾部包含保守的特異性“YXXM”基序[20-22]。
enOPAV的env基因序列雖然不會導(dǎo)致腫瘤,但是值得注意的是enOPAV表達的蛋白可以有效地阻止感染exOPAV。enOPAV表達的Env與Hyal-2結(jié)合后可以有效的阻止機體感染exOPAV,其主要原理為受體干擾[17-18]。另外一種enOPAV干擾機體感染exOPAV的方式是通過內(nèi)源性Gag蛋白阻止病毒的組裝以及病毒的釋放[18]。enOPAV能夠干擾exOPAV的生命周期,從而導(dǎo)致在高表達enOPAV的組織(雌性生殖道)中exOPAV失去了致病能力。因此,這很可能使得exOPAV在不表達enOPAV的組織(例如呼吸道)上存在的組織趨向性。
腫瘤的發(fā)展過程受多個基因、多種細胞因子調(diào)控。由致癌基因和抑癌基因突變積累造成惡性腫瘤的發(fā)病過程常與細胞凋亡、細胞增殖失控有關(guān),其中涉及的突變基因包括癌基因、抑癌基因及一些修飾基因。
有研究表明,OPAV的致瘤機制與腫瘤相關(guān)基因突變之間存在一定的聯(lián)系[23]。在OPA自然患病綿羊肺臟基因組DNA中,檢測到kras基因第1外顯子核苷酸突變位點為35G→T(第35位核苷酸由G突變?yōu)門),編碼的氨基酸位于第12密碼子:12G→V,突變率達20%;一例陽性樣品p53基因第7外顯子檢測出突變,核苷酸突變位點為:825T→C,但編碼的氨基酸未發(fā)生突變,依然是C即半胱氨酸,突變率達10%[23]。然而,OPAV Env及其亞基誘導(dǎo)NIH 3T3細胞轉(zhuǎn)化的分子機制卻可能與腫瘤相關(guān)基因突變無關(guān)[24]。
與OPAV Env轉(zhuǎn)化作用有關(guān)的信號通路中最重要的就是PI3K/Akt信號通路,該通路被激活后能夠抑制細胞凋亡和細胞周期G1期到S期的過渡,促進細胞生存和增殖[12]。研究表明,OPAV Env誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化信號通路PI3K-Akt的激活產(chǎn)物—活化的Akt能夠磷酸化一些與凋亡有關(guān)的蛋白,主要包括叉頭框(Fox)轉(zhuǎn)錄因子、caspase-9以及促凋亡 Bcl-2家族成員BAD[24]。另外,活化的Akt還能夠激活mTOR,活化的mTOR通過磷酸化核糖體S6激酶(ribosomal S6kinase,p70S6K)調(diào)節(jié)細胞周期,從而影響細胞增殖[24]。
OPA廣泛分布于內(nèi)蒙古的錫林郭勒盟、鄂爾多斯市、呼和浩特市、呼倫貝爾市等地以及我國許多養(yǎng)羊省區(qū),對種羊業(yè)危害嚴(yán)重。近年來國際上對OPAV致瘤機制的認識逐漸取得了一些共識,概括地講,過度的細胞增殖信號積累引起肺臟具有分泌作用的上皮細胞異常增生和發(fā)生惡變,最終引發(fā)腫瘤。近年來的研究表明,在OPA發(fā)病綿羊的肺臟組織中,還能夠檢測到過表達的角蛋白19(cytokerarin 19,CK19)和醛縮酶 A[25]。但在這一學(xué)說中,仍有許多重要的基礎(chǔ)問題尚未完全清楚(例如磷酸化Akt具體的激活機制),需要進一步研究。同時,OPA在組織病理學(xué)變化、超微變化等方面與人細支氣管肺泡癌(bronchiolo-alveolar carcinoma,BAC)極為相似[12],故OPA也可作為研究病毒與BAC二者間關(guān)系的理想動物模型。因此,深入探究OPAV的致瘤機制對于確定BAC相應(yīng)的防控靶點、建立動物模型,具有重要的理論意義和潛在應(yīng)用價值。
[1]McGee-Estrada K,F(xiàn)an H.Comparison of LTR enhancer elements in sheep beta retroviruses:insights into the basis for tis-sue-specific expression[J].Virus Genes,2007,35(2):303-312.
[2]McGee-Estrada K,F(xiàn)an H.Invivoandinvitroanalysis of factor binding sites in Jaagsiekte sheep retrovirus long terminal frepeat enhancer sequences:roles of HNF-3,NF-I,and C/EBP or activity in lung epithelial cells[J].J Virol,2006,80(1):332-341.
[3]劉 暢,李 磊,于立新,等.綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白及其TM亞基通過激活A(yù)kt誘導(dǎo)NIH 3T3細胞轉(zhuǎn)化[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2014(8):606-610.
[4]羅軍榮.JSRV檢測及JSRV轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)基因LTR致瘤機制相關(guān)性研究[D].內(nèi)蒙古呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.
[5]Arnaud F,Murcia P R,Palmarini M.Mechanisms of late restriction induced by an endogenous retrovirus[J].J Virol,2007,81(20):11441-11451.
[6]張月梅.綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白與綿羊透明質(zhì)酸酶2相互作用初探[D].內(nèi)蒙古呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.
[7]Miller A D.Hyaluronidase 2and its intriguing role as a cell-entry receptor for oncogenic sheep retroviruses[J].Semin Cancer Biol,2008,18(4):296-301.
[8]劉 暢,李 磊,于立新,等.穩(wěn)定表達綿羊肺腺瘤病毒受體Hyal-2蛋白細胞系的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2014,36(3):187-191.
[9]孔漢金,張克山,劉永杰,等.綿羊肺腺瘤病毒env基因致瘤機制[J].中國人獸共患病學(xué)報,2013,29(5):504-508.
[10]李 靖,瓦西力,周艷喜,等.綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠體內(nèi)的表達[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2012,33(7):7-11.
[11]CotéM,Zheng Y M,Li K,et al.Critical role of leucinevaline change in distinct low pH requirements for membrane fusion between two related retrovirus envelopes[J].J Biol Chem,2012,287(10):7640-7651.
[12]Hofacre A,F(xiàn)an H.Jaagsiekte sheep retrovirus biology and oncogenesis[J].Viruses,2010,2(12):2618-2648.
[13]Johnson C,Sanders K,F(xiàn)an H.Jaagsiekte sheep retrovirus transformation in Madin-Darby canine kidney epithelial cell three-dimensional culture[J].J Virol,2010,84(10):5379-5390.
[14]Ali A,Naoyoshi M,Jessica S,et al.The ocogenic Jagsiekte seep rtrovirus ctoplasmic tail adopts a unique conformation on a phosphocholine surface[J].J Biophys,2012,102(3):267-268.
[15]Hull S,Lim J,Hamil A,et al.Analysis of jaagsiekte sheep retrovirus(JSRV)envelope protein domains in transformation[J].Virus Genes,2012,45(3):508-517.
[16]CotéM,Zheng Y M,Albritton L M,et al.Single residues in the surface subunits of oncogenic sheep retrovirus envelopes distinguish receptor-mediated triggering for fusion at low pH and infection[J].Virology,2011,421(2):173-183.
[17]張月梅,劉淑英.內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒與宿主共進化研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2011,32(7):72-76.
[18]Sistiaga-Poveda M,Jugo B M.Evolutionary dynamics of endogenous Jaagsiekte sheep retroviruses proliferation in the domestic sheep,mouflon and Pyrenean chamois[J].Heredity(Edinb),2014,112(6):571-578.
[19]孔漢金,張克山,劉永杰,等.綿羊肺腺瘤內(nèi)、外源性env基因比較分析[J].中國動物傳染病學(xué)報,2013,21(3):18-26.
[20]Caporale M,Martineau H,DelasHeras M,et al.Host species barriers to Jaagsiekte sheep retrovirus replication and carcinogenesis[J].J Virol,2013,87(19):10752-10762.
[21]Zhang K,Kong H,Liu Y,et al.Diagnosis and phylogenetic analysis of ovine pulmonary adenocarcinoma in China[J].Virus Genes,2014,48(1):64-73.
[22]韓云珍,肖雪梅.綿羊肺腺瘤病毒SD株的鑒定及分子特征分析[J].中國獸醫(yī)雜志,2013,49(12):31-32.
[23]周艷喜,于立新,張月梅,等.綿羊肺腺瘤kras和其他相關(guān)基因突變的檢測[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2013,34(2):6-11.
[24]劉 暢.JSRV囊膜蛋白及其亞基誘導(dǎo)NIH 3T3細胞轉(zhuǎn)化與分子發(fā)生機制的研究[D].內(nèi)蒙古呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.
[25]Kycko A,Reichert M.Overexpression of aldolase A and cytokeratin 19in ovine pulmonary adenocarcinoma[J].Pol J Vet Sci,2012,15(4):703-709.