李麗敏，王 燕，崔貝貝，林 敏，張 磊，左玉柱，王家鑫

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室，保定 071000)

肥大細(xì)胞對重組口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式識別效應(yīng)

李麗敏#，王 燕#，崔貝貝，林 敏，張 磊，左玉柱，王家鑫*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室，保定 071000)

為研究肥大細(xì)胞對重組口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式識別作用，將VP1-VP4蛋白負(fù)載經(jīng)TLR2/TLR4抑制劑、甘露糖受體抑制劑或清道夫受體抑制劑預(yù)處理的小鼠肥大細(xì)胞系P815，在不同時間點(diǎn)觀察其脫顆?，F(xiàn)象，并用ELISA檢測細(xì)胞上清液中TNF-α的含量。結(jié)果顯示，清道夫受體抑制劑處理組在負(fù)載VP1-VP4蛋白15和30 min時P815細(xì)胞脫顆粒數(shù)目均極顯著低于重組VP1-VP4蛋白組(P<0.001)。在負(fù)載VP1-VP4蛋白24 h時，各抑制劑處理組的TNF-α含量均極顯著低于VP1-VP4蛋白組(P<0.001)，其中以甘露糖受體抑制劑處理組含量最低。這表明小鼠肥大細(xì)胞系P815主要通過清道夫受體識別FMDV VP1-VP4并引起脫顆粒現(xiàn)象的發(fā)生，而甘露糖受體和TLR2/TLR4識別FMDV VP1-VP4則是引起P815細(xì)胞分泌TNF-α的主要模式識別機(jī)制，其中以甘露糖受體的作用最強(qiáng)。

肥大細(xì)胞；模式識別受體；重組口蹄疫病毒VP1-VP4；脫顆粒；α-腫瘤壞死因子

肥大細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞前體，遷移至外周組織中發(fā)育成熟，廣泛分布于皮膚和黏膜等部位，與樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等共同組成抗感染的第一道防線。該細(xì)胞可分泌多種生物活性物質(zhì)，在炎癥和超敏反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，病原體可刺激肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺、前列腺素、白三烯和細(xì)胞因子，從而啟動固有免疫和適應(yīng)性免疫[1-3]。A.L.St John等用流感病毒血凝素作抗原，以肥大細(xì)胞顆粒成分為佐劑制成的疫苗可使受免小鼠抵抗致死劑量的病毒攻擊，為新型疫苗佐劑的篩選研究開辟了新途徑[4]。

肥大細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體 (toll-like receptor，TLR)、NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)、甘露糖受體(mannose receptor，MR)和清道夫受體(scavenger receptor，SR)等模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)。試驗證明，細(xì)菌LPS和病毒結(jié)構(gòu)蛋白可被肥大細(xì)胞膜表面的TLR2和TLR4識別，導(dǎo)致肥大細(xì)胞活化并釋放TNF-α、IL-6、IL-4和IL-13[5-6]。與此相反，機(jī)體對金黃色葡萄球菌肽聚糖的細(xì)胞免疫應(yīng)答雖然必須有肥大細(xì)胞的參與，但卻既不依賴TLR2和TLR4，也不依賴TNF-α，提示肽聚糖可能被其他PRR識別[7]。應(yīng)用模式識別受體抑制劑或特異性抗體阻斷以及RNA干擾試驗對鼠源肥大細(xì)胞系P815的研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞可通過TLR2、TLR4、NOD樣受體、蛋白酶活化受體等受體識別鏈球菌、流感病毒和蛋白酶，并引起脫顆?；蚍置赥NF-α、IL-6、IL-4、IL-12[8-11]。由于咽部是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)入侵機(jī)體的門戶，而咽黏膜中有大量肥大細(xì)胞分布，那么肥大細(xì)胞能否以PRR識別FMDV并被激活呢？

臨床研究證明，清除病毒感染不僅依賴高水平的中和抗體，而且還必須有活化CD8+T細(xì)胞參與。研究發(fā)現(xiàn)，口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1富含T、B細(xì)胞抗原表位，既可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，又可刺激機(jī)體產(chǎn)生對7種血清型FMDV具有交叉保護(hù)作用的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答[12]，VP4亦含T、B細(xì)胞抗原表位，且在不同血清型的FMDV中高度保守，可被多種單體型MHC分子識別[13]，并且研究表明樹突狀細(xì)胞可以通過MR和SR識別FMDV VP1-VP4蛋白[14]，故本試驗以重組FMDV VP1-VP4作為免疫原負(fù)載經(jīng)TLR2/TLR4抑制劑OxPAPC[15]、MR抑制劑甘露聚糖[16]或SR抑制劑番瀉苷B[17]預(yù)處理的小鼠肥大細(xì)胞系P815，觀察其在不同時間的脫顆?，F(xiàn)象，檢測其分泌的TNF-α，以揭示肥大細(xì)胞對口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的模式識別作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

小鼠肥大細(xì)胞系P815由河北大學(xué)免疫學(xué)教研室曹志然教授惠贈。10%胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司。TLR2和TLR4抑制劑OxPAPC購自Invivogen公司，清道夫受體抑制劑番瀉苷B(純度99%)購自成都曼斯特生物科技有限公司，甘露糖受體抑制劑甘露聚糖和甲苯胺藍(lán)購自Sigma公司，小鼠TNF-α ELISA試劑盒為eBioscience公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組FMDV VP1-VP4蛋白的制備 重組VP1-VP4的制備按本室報道的方法進(jìn)行[18]。主要步驟如下：將陽性重組菌按1∶100的比例接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm=0.8～1.0。加入IPTG，30 ℃振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。離心菌液棄上清，用PBS重懸后加入上樣緩沖液，離心，取上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE，回收目的蛋白VP1-VP4，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 肥大細(xì)胞培養(yǎng)與負(fù)載VP1-VP4蛋白濃度的確定 將生長良好的肥大細(xì)胞P815用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成5×104·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于放置有圓形蓋玻片的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于24 h分別用質(zhì)量濃度為5、10、15和20 μg·mL-1的VP1-VP4蛋白負(fù)載，每個質(zhì)量濃度和每個時相均設(shè)3個重復(fù)孔。

于負(fù)載后15、30、45和60 min用4%多聚甲醛(4 ℃)固定肥大細(xì)胞3 min，用PBS(pH 7.2)沖洗3次，然后置甲苯胺藍(lán)染液中30 s，快速水洗，并用300 mL·L-1乙醇-PBS(pH 7.2) 分色，用光學(xué)樹膠封片。在400倍放大的視野中隨機(jī)取5個視野，每個視野中隨機(jī)觀察30個肥大細(xì)胞，分別記錄體積增大和脫顆粒的肥大細(xì)胞數(shù)，以肥大細(xì)胞充分脫顆粒為活化指標(biāo)[19]，確定活化肥大細(xì)胞所需的最佳VP1-VP4蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.2.3 肥大細(xì)胞識別VP1-VP4模式識別受體的研究 由于肥大細(xì)胞的吞噬功能較弱，并且樹突狀細(xì)胞可通過MR和SR識別VP1-VP4[14，18]，所以我們假設(shè)TLR2、TLR4、MR和SR可能參與肥大細(xì)胞對VP1-VP4的識別。為此，在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔各接種5×104肥大細(xì)胞，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄上清。然后加入新配制的含不同抑制劑和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，每個時間點(diǎn)每種抑制劑均設(shè)三個重復(fù)孔，其中OxPAPC、甘露聚糖和番瀉苷B的濃度分別為30 μg·mL-1、3 mg·mL-1和0.23 mg·mL-1。作用1 h，按照1.2.2確定的最佳質(zhì)量濃度加入VP1-VP4。上述處理組分別記為MC+OxPAPC+VP1-VP4、MC+Mannan+VP1-VP4和MC+番瀉苷B+VP1-VP4，同時設(shè)只負(fù)載VP1-VP4對照組(MC+VP1-VP4)及肥大細(xì)胞空白對照組(MC)。

于負(fù)載VP1-VP4蛋白后15、30、45、60 min，固定肥大細(xì)胞，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，觀察肥大細(xì)胞的形態(tài)變化與脫顆?，F(xiàn)象。于負(fù)載VP1-VP4后0.5、1、6、12和24 h收集肥大細(xì)胞上清液，以3 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min，按照ELISA試劑盒說明書中的方法測定上清液中TNF-α的含量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 將上述試驗所獲得的數(shù)據(jù)按照Two-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析，所用軟件為Graphpad Prism 5，以P<0.05為差異顯著，以P<0.01為差異極顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 負(fù)載VP1-VP4蛋白劑量的確定

由于肥大細(xì)胞脫顆粒被視為其在受到免疫原(immunogen)刺激后充分活化的標(biāo)志[19]，故以脫顆粒為指標(biāo)篩選活化肥大細(xì)胞所需負(fù)載的VP1-VP4蛋白用量。通過對甲苯胺藍(lán)染色的肥大細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，重組VP1-VP4可引起肥大細(xì)胞的脫顆粒(圖1A)。從圖1B可以看出，以15與20 μg·mL-1劑量的VP1-VP4蛋白負(fù)載肥大細(xì)胞后15 min，脫顆粒的細(xì)胞數(shù)量顯著大于對照組(P<0.05或P<0.001)，而5與10 μg·mL-1的劑量則不能充分誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒。然而至負(fù)載后45和60 min，小劑量的VP1-VP4蛋白也誘導(dǎo)了十分明顯的脫顆?，F(xiàn)象，與空白對照組有極顯著差異(P<0.001)。值得注意的是，15 μg·mL-1的VP1-VP4不僅可在第一時間引起肥大細(xì)胞脫顆粒，而且這種誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出隨時間延長而逐漸增強(qiáng)的變化。與此不同，20 μg·mL-1的VP1-VP4蛋白則可迅速誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，但此后脫顆粒作用則無明顯變化，故將15 μg·mL-1劑量作為后續(xù)試驗負(fù)載肥大細(xì)胞的用量。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖1 重組VP1-VP4蛋白刺激肥大細(xì)胞脫顆粒的劑量確定Fig.1 Titration of the dosage of recombinant VP1-VP4 protein that stimulates mast cell degranulation

2.2 肥大細(xì)胞識別VP1-VP4的模式識別受體

大量試驗證明，細(xì)菌、病毒和真菌都可激活肥大細(xì)胞，根據(jù)活化肥大細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能變化，將活化作用分為脫顆粒和細(xì)胞因子分泌兩個時相，前者發(fā)生在早期，后者通常在脫顆粒后數(shù)小時發(fā)生，其中TNF-α是最早釋放的細(xì)胞因子之一[1，20]。

2.2.1 VP1-VP4負(fù)載經(jīng)不同抑制劑處理的肥大細(xì)胞脫顆粒觀察 上述試驗證明，重組VP1-VP4蛋白可以活化肥大細(xì)胞。那么，肥大細(xì)胞是通過哪些模式識別受體識別FMDV VP1-VP4的呢？為此，用TLR2/4抑制劑、MR抑制劑和SR抑制劑阻斷肥大細(xì)胞利用這四種受體對VP1-VP4的識別，觀察負(fù)載VP1-VP4后肥大細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示，體積增大的細(xì)胞數(shù)目在各個時相的不同處理組間均差異不顯著(P>0.05)(圖2A)。但抑制SR處理組在負(fù)載蛋白質(zhì)15和30 min脫顆粒的肥大細(xì)胞數(shù)目均顯著低于 MC+VP1-VP4處理組(P<0.005或P<0.001)(圖2B)。若以活化細(xì)胞總數(shù)(即體積增大的細(xì)胞數(shù)目與脫顆粒的細(xì)胞數(shù)目之和)為指標(biāo)，抑制SR處理組在負(fù)載蛋白質(zhì)15 min極顯著低于MC+VP1-VP4處理組(P<0.01)，其他處理組雖然有不同程度的減少，但是與MC+VP1-VP4處理組差異不顯著(圖2C)，這表明肥大細(xì)胞在受到VP1-VP4刺激后發(fā)生脫顆?，F(xiàn)象主要是通過SR的模式識別所介導(dǎo)的。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖2 VP1-VP4負(fù)載經(jīng)不同抑制劑處理的肥大細(xì)胞脫顆粒狀態(tài)Fig.2 The degranulation profile of mast cells triggered by VP1-VP4 after individual inhibitor treatments

2.2.2 VP1-VP4負(fù)載經(jīng)不同抑制劑處理的肥大細(xì)胞分泌TNF-α的檢測 業(yè)已證明，肥大細(xì)胞可合成并儲存TNF-α，當(dāng)其受到刺激時可迅速分泌，所以TNF-α分泌也被作為衡量肥大細(xì)胞活化的指標(biāo)[5-6]。本試驗為探明TLR2、TLR4、MR和SR四種模式識別受體在VP1-VP4活化肥大細(xì)胞中的作用，先用相應(yīng)的抑制劑阻斷這些受體，然后負(fù)載VP1-VP4，并在不同時間點(diǎn)收集上清液，用ELISA檢測不同抑制劑處理組肥大細(xì)胞上清液中TNF-α的含量。結(jié)果顯示，在0.5、1、6和12 h，四種受體抑制劑處理組與MC+VP1-VP4組及空白對照組的TNF-α含量相比差異不顯著。但是在24 h，各抑制劑處理組的TNF-α含量均極顯著低于MC+VP1-VP4組(P<0.001)，其中以MR抑制劑處理組含量最低，幾乎與空白對照組相同(圖3)。此結(jié)果表明，肥大細(xì)胞可能通過MR、TLR2/TLR4和SR識別FMDV VP1-VP4，從而引起肥大細(xì)胞分泌TNF-α，其中以MR介導(dǎo)的模式識別作用最強(qiáng)。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖3 不同處理組肥大細(xì)胞上清液中TNF-α的含量Fig.3 The contents of TNF-α in mast cell supernatants from every group

3 討 論

雖然對肥大細(xì)胞在機(jī)體抗感染免疫中作用研究歷史很短，但對肥大細(xì)胞在抗細(xì)菌免疫應(yīng)答中的作用已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可。然而，對肥大細(xì)胞在抗病毒免疫應(yīng)答中的作用卻仍然了解很少[5，21]。盡管目前已經(jīng)證實哺乳動物的肥大細(xì)胞可識別登革熱病毒、單純皰疹病毒、流感病毒、新城疫病毒、呼吸道合胞體病毒、仙臺病毒和腦心肌炎病毒等[9，22]，這些病毒或誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，或刺激其分泌細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶，但對于肥大細(xì)胞識別病毒的受體還知之甚少[5，6]，而且也未見肥大細(xì)胞通過模式識別受體感知FMDV的報道。

本研究將重組FMDV VP1-VP4蛋白負(fù)載小鼠肥大細(xì)胞系P815，發(fā)現(xiàn)其可以引起該細(xì)胞脫顆粒(圖1和圖2)，并在負(fù)載該蛋白質(zhì)后24 h分泌TNF-α(圖3)，這表明FMDV VP1-VP4蛋白可以活化小鼠肥大細(xì)胞系P815，但誘導(dǎo)該細(xì)胞分泌TNF-α的時間卻明顯晚于其他病原體對肥大細(xì)胞的刺激[1，5]。由于TNF-α可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其抗原提呈功能，所以FMDV結(jié)構(gòu)蛋白(即使用大劑量)延遲肥大細(xì)胞系P815分泌TNF-α的現(xiàn)象可能與滅活FMDV疫苗免疫保護(hù)誘導(dǎo)期長有關(guān)。值得注意的是，大劑量的VP1-VP4可以迅速激活P815，使其脫顆粒，而小劑量的VP1-VP4雖然在早期不能誘導(dǎo)其脫顆粒，但隨著負(fù)載時間的延長，其刺激鼠源肥大細(xì)胞系P815脫顆粒的作用甚至還強(qiáng)于大劑量的VP1-VP4。由于活化肥大細(xì)胞所釋放的生物介質(zhì)是決定樹突狀細(xì)胞抗原提呈方向的重要因素[1，4-5]，所以該研究結(jié)果可能對科學(xué)設(shè)計與正確使用口蹄疫疫苗具有一定的指導(dǎo)意義。

為了探明VP1-VP4活化肥大細(xì)胞的觸發(fā)機(jī)制，本試驗利用OxPAPC抑制TLR2和TLR4，用番瀉苷B抑制清道夫受體，用甘露聚糖抑制甘露糖受體，然后負(fù)載VP1-VP4，并與正常肥大細(xì)胞進(jìn)行比較，藉此明確肥大細(xì)胞識別VP1-VP4的模式識別受體。從圖2可以看出，阻斷SR可顯著抑制肥大細(xì)胞系P815脫顆粒，但對其分泌TNF-α的抑制作用很弱(圖3)。與此相反，阻斷MR則對該細(xì)胞分泌TNF-α的抑制作用十分明顯，而對肥大細(xì)胞系P815脫顆粒的抑制作用相對較弱。這提示SR是肥大細(xì)胞系P815識別VP1-VP4后觸發(fā)脫顆粒的主要受體，而MR則是肥大細(xì)胞系P815識別VP1-VP4后觸發(fā)分泌TNF-α的主要受體。然而我們注意到，雖然阻斷TLR2和TLR4處理組的脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)量與MC+VP1-VP4處理組差異不顯著，但是該組TNF-α的分泌水平卻在負(fù)載蛋白質(zhì)后24 h極顯著低于MC+VP1-VP4處理組(圖2C和圖3)，這提示TLR2或TLR4可能與MR協(xié)同調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞系P815識別FMDV VP1-VP4后的TNF-α分泌過程，盡管這種抑制作用弱于MR阻斷的效果。

需要指出的是，SR不僅是肥大細(xì)胞系P815識別VP1-VP4觸發(fā)脫顆粒的最主要受體，而且SR對VP1-VP4的識別也可促進(jìn)其分泌TNF-α，這表明SR不僅是肥大細(xì)胞的吞噬性受體，而且也是介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的模式識別受體。樹突狀細(xì)胞也表達(dá)SR、MR和TLR等受體，但樹突狀細(xì)胞通過SR和MR對口蹄疫病毒VP1-VP4的識別卻可抑制其抗原提呈功能[14，18]。因此如何協(xié)調(diào)肥大細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞對VP1-VP4模式識別作用之間的關(guān)系，從而有效調(diào)動二者參與對FMDV的免疫應(yīng)答將是一個很值得深入研究的課題。

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(編輯 白永平)

The Effectiveness of Mast Cell Pattern Recognition of Recombinant VP1-VP4 of Foot-and-mouth Disease Virus

LI Li-min#，WANG Yan#，CUI Bei-bei，LIN Min，ZHANG Lei，ZUO Yu-zhu，WANG Jia-xin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China)

The objective of this study was designed to investigate the effectiveness of mast cell pattern recognition of recombinant VP1-VP4 of foot-and-mouth disease virus(FMDV).To this end，murine mast cell line P815 were pulsed with the recombinant VP1-VP4 of FMDV after inhibitors of Toll-like receptor 2/4(OxPAPC)，mannose receptors(Mannan)，and scavenger receptors(Sennoside B) were administered to murine mast cell line，respectively.Degranulation of P815 mast cells stained with toluidine blue was observed at the given time.And the levels of TNF-α in P815 mast cell culture supernatants were determined by ELISA at different timepoints.It was showed that the number of degranulated P815 mast cells with administration of scavenger receptor inhibitor was significantly lower than that of cells pulsed with recombinant VP1-VP4 protein at 15 min and 30 min(P<0.001).Intriguingly，the TNF-α release from the mast cell line activated by recombinant VP1-VP4 at 24 h was significantly blocked with three inhibitors(P<0.01)，of which，mannan，a mannose receptor inhibitor，showed the strongest inhibition on TNF-α release.Our data indicate that murine mast cell line P815 degranulation triggered by recombinant VP1-VP4 was predominantly mediated via the recognition of scavenger receptors,while the TNF-α release from the activated mast cells was constitutively initiated with the recognition of mannose receptors，TLR2，and TLR4.Of note，recognition of recombinant VP1-VP4 through mannose receptors plays a predominant role in triggering TNF-α release from P815 mast cells activated by recombinant VP1-VP4.

mast cell；pattern recognition receptor；recombinant FMDV VP1-VP4 protein；degranulation；TNF-α

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.021

2015-01-07

國家自然科學(xué)基金(31402174)；河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科青年基金 (20130101)

李麗敏(1982-)，女，河北元氏人，講師，博士，主要從事免疫學(xué)教學(xué)與科研工作，E-mail:lilimin03@163.com；王 燕(1987-)，女，河北廣平人，碩士生，主要從事肥大細(xì)胞的模式識別研究，E-mail:wangyan871203@163.com。二人并列第一作者

*通信作者：王家鑫，教授，E-mail：mastwang@163.com

S852.4

A

0366-6964(2015)09-1644-06