任航行，王高富，陸 健，李 杰，蔣 婧，劉良佳，周 鵬*

(1.重慶市畜牧科學院，榮昌 402460；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，榮昌 402460；3.全國畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心，北京 100193；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，蘭州 730070)

不同膚色山羊皮膚組織形態(tài)學及黑色素生成相關(guān)基因的表達分析

任航行1，2，王高富1，2，陸 健3，李 杰1，4，蔣 婧1，2，劉良佳1，2，周 鵬1，2*

(1.重慶市畜牧科學院，榮昌 402460；2.重慶市山羊工程技術(shù)研究中心，榮昌 402460；3.全國畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心，北京 100193；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，蘭州 730070)

旨在闡明酉州烏羊皮膚發(fā)育的組織形態(tài)學特點以及黑色素高度沉積的可能分子機制，本研究選取渝東白山羊(白色皮膚)為對照，對100日齡酉州烏羊和渝東白山羊胎兒皮膚組織進行了組織形態(tài)學分析；并檢測了成年酉州烏羊和渝東白山羊皮膚組織以及B16黑色素細胞增殖、分化階段Pax3、Mitf與Tyr的表達變化。結(jié)果表明，在山羊胎兒皮膚快速發(fā)育階段，兩品種間皮膚黑色素沉積差異明顯；Pax3與Tyr在酉州烏羊皮膚中表達量顯著高于渝東白山羊(P<0.001)，而Mitf則無明顯差異(P>0.05)；相對于細胞增殖階段，B16細胞在分化時Pax3表達顯著下調(diào)(P<0.001)，Tyr的表達顯著上調(diào)(P<0.01)，而Mitf無明顯差異(P>0.05)。研究結(jié)果提示，在皮膚發(fā)育分化的早期階段，酉州烏羊與渝東白山羊黑色素細胞的遷移路線可能不同；Pax3下調(diào)與Tyr上調(diào)是色素細胞分化并生成黑色素的必要條件；酉州烏羊皮膚黑色素高度沉積與Pax3、Tyr的大量表達有關(guān)。

酉州烏羊；皮膚著色；組織形態(tài)；基因表達

酉州烏羊是迄今為止人們發(fā)現(xiàn)的唯一一種具烏皮特征的山羊品種，是我國珍貴的特色地方山羊遺傳資源。目前，酉州烏羊僅分布于重慶市酉陽地區(qū)。酉州烏羊全身皮膚為烏色，眼、鼻、嘴、肛門、陰門等處可視黏膜為烏色，骨骼關(guān)節(jié)帶烏色。該羊?qū)僦行◇w型，全身被毛白色，一條黑色背脊線，兩黑色眼圈。我們前期已經(jīng)對酉州烏羊的生長發(fā)育性能、屠宰性能和肉品質(zhì)理化特性進行了初步研究[1-3]，還分析了酉州烏羊的血液生理生化指標[4]。這些研究表明，酉州烏羊的確與其他品種山羊存在較大差異。盡管可以確定，烏皮羊與非烏皮羊之間這種皮膚顏色差異是由于黑色素沉積差異造成的，但對于山羊皮膚著色差異的分子基礎(chǔ)研究還未見報道。

黑色素是由黑色素細胞產(chǎn)生的一種能在染料下顯色的醌類化合物，而胚胎期間色素細胞的遷移路線、增殖速率及分化結(jié)果決定了機體組織的顏色。Pax3不但在神經(jīng)干細胞分化為黑色素干細胞的發(fā)育過程中起著重要作用[5]，而且還調(diào)控著色素合成代謝過程[6-8]。Mitf是Pax3的下游靶基因，在色素干細胞的存活與維持方面起關(guān)鍵作用[9]。此外，Mitf還是啟動其下游黑色素合成相關(guān)基因(如Tyr、Tyrp1與Dct)的上游調(diào)控子[10-11]。Tyr為Mitf的靶基因，也是編碼黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶基因。那么，這3個影響色素沉積的重要基因在烏羊與非烏羊皮膚的表達是否有差異？他們是否與兩品種山羊皮膚的色素沉積有關(guān)？本研究以酉州烏羊和渝東白山羊(白色皮膚)為研究對象，初步分析了酉州烏羊和渝東白山羊皮膚的組織形態(tài)學差異，檢測了兩品種山羊皮膚Pax3、Mitf、Tyr基因的表達，同時還分析了B16黑色素細胞增殖、分化階段這3個關(guān)鍵基因的表達。為將來進一步闡明烏皮羊與非烏皮羊表型背后的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本

試驗用酉州烏羊(烏色皮膚)與渝東白山羊(白色皮膚)在同一飼養(yǎng)管理條件下分圈全舍飼飼養(yǎng)，自由采食(青貯玉米、甘草、混合精料)、飲水。 收集妊娠階段100 d酉州烏羊和渝東白山羊胎兒各3只，采集背腹部皮膚組織，甲醛固定，用于組織形態(tài)學分析(H.E.染色)；另外采集6月齡雄性酉州烏羊(n=3)與渝東白山羊(n=3)皮膚樣本，液氮保存用于基因表達檢測。

1.2 主要試劑

DMEM、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素雙抗、0.25%胰酶(0.05% EDTA)、D-PBS均購自Gibco；96孔板、T25細胞培養(yǎng)瓶、15 mL離心管購自Corning；Power SYBR-Green PCR Master Mix Kit購自美國ABI公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Life公司； RNA酶抑制劑購自TaKaRa公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.3 組織形態(tài)學分析

皮膚組織H.E.染色依據(jù)文獻[12]的方法進行。

1.4 B16黑色素細胞繼代培養(yǎng)

具體操作步驟：(1)吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入3 mL預熱的D-PBS清洗2～3次，吸去D-PBS；(2)加入預熱的0.25%胰酶(0.05% EDTA)1 mL，37 ℃消化3～5 min；(3)顯微鏡下觀察，當細胞胞質(zhì)回縮，細胞大片從培養(yǎng)瓶上脫落時，加入2～3 mL含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化；(4)輕輕吹打均勻，吸入到15 mL離心管中，500 g離心5 min；(5)棄上清，加入1 mL含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，吹打均勻；(6)細胞計數(shù)，部分細胞按照2×105個·mL-1密度接種到T25細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 MTT法測定細胞生長曲線

接種細胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1 000～10 000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。細胞在1640培養(yǎng)基 + 10%胎牛血清條件下培養(yǎng)4 d，分別在0、24、48、72、96 h時間點取樣。每孔加MTT溶液(5 mg·mL-1用PBS 配) 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，每個時間點至少5個生物學重復。記錄結(jié)果以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.6 Real-time PCR

分別從兩品種山羊皮膚組織與B16細胞中提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，再分別進行定量PCR分析。反應(yīng)條件：95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性 30 s，退火溫度退火30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。每個基因做4次重復。GAPDH為內(nèi)參基因。Pax3、Mitf、Tyr的相對定量表達應(yīng)用ΔΔCt法計算。

1.7 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SAS 8.0軟件中的t-test方法分別檢驗烏皮與白皮山羊間，及B16細胞增殖與分化條件下Pax3、Mitf、Tyr基因的表達差異。

2 結(jié) 果

2.1 酉州烏羊與渝東白山羊皮膚組織學分析

據(jù)觀察，酉州烏羊皮膚顏色隨著年齡增加而加深，為了探究烏質(zhì)表型發(fā)生早期皮膚組織形態(tài)學特征，對胎兒期100日齡的烏皮與非烏皮山羊的皮膚組織進行了H.E.染色。分析發(fā)現(xiàn)，胎兒期100日齡酉州烏羊表皮與真皮組織均含有較多的黑色素顆粒，而在對照樣本(渝東白山羊)皮膚組織中未檢測到明顯的黑色素沉積(圖1)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，酉州烏羊皮膚除毛囊周圍有黑色素顆粒外，皮膚的其他部位也廣泛分布著黑色素顆粒(圖1)。這些結(jié)果暗示，在皮膚發(fā)育分化的早期階段，烏皮羊與非烏皮羊黑色素細胞的遷移路線可能存在差異。

A、C分別為酉州烏羊100 d胎兒皮膚的不同放大倍數(shù)H.E.染色圖片； B、D分別為渝東白山羊100 d胎兒皮膚的相應(yīng)H.E.染色圖片；圖A和B比例尺為50 μm，圖C和D比例尺為10 μm．黑色素顆粒(棕褐色)用黃色箭頭標注A，C indicate the dark-skin sections by H.E.staining at various resolutions，while B and D are images of the normal skin.The scale bar for A and B is 50 μm，and 10 μm for C and D.The melanin is indicated by the yellow arrow圖1 酉州烏羊與渝東白山羊100 d胎兒皮膚組織切片 H.E.染色Fig.1 H.E staining of the 100 d-fetal dermal sections in Youzhou Dark-skin goat and Yudong White goat

2.2 酉州烏羊與渝東白山羊皮膚組織Pax3、Mitf、Tyr的表達

對不同膚色的成年山羊皮膚組織Pax3、Mitf、Tyr基因qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Pax3與Tyr在酉州烏羊皮膚中表達量顯著高于渝東白山羊(P<0.001)，而Mitf則無明顯差異(圖2)。初步說明Pax3和Tyr的高表達與酉州烏羊的皮膚色素沉積高度相關(guān)。

皮膚總RNA用于定量PCR分析，GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-△△Ct方法分別計算兩種膚色山羊皮膚組織mRNA的相對表達量。目的基因的相對含量表示為“平均值±標準差”(n=3)．***.P<0.001Skin total RNA was used for qPCR analysis.Expression was quantified relative to GAPDH expression in each group using the 2-△△Ct method.The data are shown as the “mean±SD”(n=3).***.P<0.001圖2 Pax3、Tyr、Mitf mRNA在不同膚色山羊皮膚組織中的表達Fig.2 The mRNA expression of Pax3，Tyr and Mitf in skin with different colors in goats

2.3 B16細胞增殖與分化過程中Pax3、Mitf與Tyr的表達

為了進一步從細胞學層面研究Pax3、Tyr、Mitf表達與黑色素生成的關(guān)系，首先應(yīng)用MTT法繪制了B16細胞增殖曲線，發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)在1640培養(yǎng)基 + 10% FBS 條件下培養(yǎng)72 h增殖達到頂峰(圖3)。 隨著B16細胞進一步分化，開始分泌黑色素顆粒?；虮磉_分析發(fā)現(xiàn)，相對于增殖階段，Pax3的表達在分化時顯著下調(diào)(P<0.001)，而Tyr的表達顯著上調(diào)(P<0.01)，Mitf的表達在分化與增殖階段無明顯變化(圖4)。這表明Pax3下調(diào)與Tyr上調(diào)是B16色素細胞分化并合成黑色素的重要前提條件。

由于Tyr是細胞內(nèi)黑色素合成通路中的關(guān)鍵調(diào)控酶，Tyr的表達量直接決定了黑色素合成的速率。酉州烏羊皮膚組織TyrmRNA表達顯著高于渝東白山羊，暗示必定存在著調(diào)控Tyr高表達的信號通路，而Pax3可能是此通路上的調(diào)節(jié)分子之一。

B16細胞在1640培養(yǎng)基 + 10%胎牛血清條件下分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，經(jīng)MTT 孵育后在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定490 nm光吸收值(OD值)。細胞數(shù)量與OD490 nm值成正比B16 cells were cultured in 1640 medium+10% FBS for 0，24，48，72 and 96 h.The OD(optical density) values at 490 nm were examined in Enzyme immunoassay instrument after incubation with MTT at each time point.The cell counts are indicated by the OD value at 490 nm at each time point圖3 B16細胞增殖曲線Fig.3 The proliferation curve of the B16 cell line by MTT method

細胞抽提物用于定量PCR檢測，GAPDH為內(nèi)參基因，應(yīng)用2-△△Ct 法計算增殖與分化條件下B16細胞的基因相對表達。目的基因的相對含量表示為“均值±標準差”(n=3)．** .P<0.01；***.P<0.001Cell lysates were used for gene expression by qPCR.Gene expression was quantified relative to GAPDH expression using the 2-△△Ct method.The data are shown as the “mean±SD”(n=3).**.P<0.01；***.P<0.001圖4 Pax3、Mitf、Tyr mRNA在增殖與分化的B16細胞中的表達分析Fig.4 The mRNA levels of Pax3，Mitf and Tyr in the proliferating and differentiating B16 cells

3 討 論

動物的毛發(fā)、皮膚和眼睛的顏色均由黑色素的相對數(shù)量、性質(zhì)和分布所決定。黑色素細胞不僅負責在膜限制的細胞器(黑素體)內(nèi)合成黑色素，而且負責把黑素體運輸?shù)街車谋砥ぜ毎?角質(zhì)細胞)。哺乳動物和鳥類存在著顯著不同的兩種黑色素：即真黑色素(Eumelanin)和偽黑色素(Pheomelanin)，而酪氨酸激酶(Tyr)是色素合成過程中的限速酶。楊舒黎等研究發(fā)現(xiàn)，烏骨綿羊肌肉、血漿Tyr酶活性顯著高于非烏質(zhì)表型的綿羊，表明Tyr基因與綿羊烏質(zhì)性狀有關(guān)[13-14]。高莉等研究發(fā)現(xiàn)，棕色羊駝皮膚TyrmRNA的表達量是白色羊駝的13.669倍[15]。對禽類的研究也發(fā)現(xiàn)，黑色羽衣鵪鶉Tyr基因表達量要顯著高于淺色羽衣鵪鶉[16]。S.Makpol等研究表明，抗氧化劑維生素E處理顯著下調(diào)了人皮膚色素細胞Tyr、Tyrp1 與Tyrp2基因的表達，進而抑制色素生成[17]。而己烯雌酚可通過cAMP-PKA上調(diào)Tyr，增加了B16細胞的黑色素生成[18]。此外，人胚胎腎細胞(HEK293)過表達Tyr也會出現(xiàn)著色加深[19]。這些研究充分暗示，Tyr高表達是動物機體組織黑色素沉積的重要前提條件。本研究發(fā)現(xiàn)，酉州烏羊(烏黑色皮膚)皮膚Tyr表達量顯著高于野生型(白色皮膚)，進一步佐證了以上推論。但究竟是哪些因子影響了綿羊和山羊黑色素生成通路導致Tyr表達升高，促進了黑色素的合成與沉積？還有待于進一步研究。

盡管Mitf是黑色素細胞發(fā)育和黑素色生成通路中的重要調(diào)節(jié)因子[20]，其突變可導致人[20-21]、小鼠[21-23]以及水貂[24]的聽覺、皮膚或毛發(fā)組織的色素沉積異常。然而，本研究從體內(nèi)和體外分析中均未檢測到MitfmRNA表達量的顯著變化。本研究發(fā)現(xiàn)，Mitf的上游調(diào)控基因Pax3 mRNA在烏羊皮膚組織中高豐度表達(圖2)，Pax3不但是黑色素細胞保持干細胞狀態(tài)的關(guān)鍵基因[5]，而且還調(diào)控著細胞的遷移行為[8，25-26]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Pax3不僅在黑色素腫瘤中表達，而且也在人類正常皮膚組織的黑色素細胞中廣泛表達[27-28]，說明正常皮膚組織中也存在著部分處于未分化狀態(tài)或增殖狀態(tài)的黑色素細胞。此外，本研究的體外試驗(圖3)也顯示，Pax3表達顯著下調(diào)是B16細胞分化并產(chǎn)生黑色素的重要前提條件。這些結(jié)果表明，與非烏皮羊相比，酉州烏羊皮膚組織存在著更多的未分化或者正處于增殖狀態(tài)的黑色素細胞。這種黑色素細胞數(shù)量上的差異可能與烏羊皮膚組織Pax3與Tyr高表達有關(guān)。C.D.Faraco 等的研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期成黑素細胞遷移路線的不同導致了烏骨雞與白來航雞多個組織間黑色素沉積的巨大差異[29]。朱芷葳等研究發(fā)現(xiàn)，Pax3在有色被毛羊駝皮膚中表達量要顯著高于白色被毛羊駝[30]，暗示著Pax3可能參與了黑色素細胞的遷移、增殖和分化。本研究的組織形態(tài)學與基因表達分析結(jié)果也暗示，酉州烏羊與渝東白山羊皮膚黑色素細胞遷移路線可能存在差異，但其具體的分子機制有待于進一步深入研究。

4 結(jié) 論

在皮膚發(fā)育分化的早期階段，酉州烏羊與渝東白山羊黑色素細胞的遷移路線可能存在差異；Pax3下調(diào)與Tyr上調(diào)是B16細胞分化生成黑色素的必要條件；酉州烏羊皮膚黑色素高度沉積與Pax3、Tyr的大量表達有關(guān)。

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(編輯 郭云雁)

The Characteristic Histomorphology of Various Skin Colors and Expression of Genes Involved in Melanogenesis in Goats

REN Hang-xing1，2，WANG Gao-fu1，2，LU Jian3，LI Jie1，4， JIANG Jing1，2，LIU Liang-jia1，2，ZHOU Peng1，2*

(1.ChongqingAcademyofAnimalSciences，Rongchang402460，China；2.ChongqingEngineeringResearchCenterforGoat，Rongchang402460，China；3.NationalCenterforPreservationandUtilizationofAnimalGeneticResources，NationalAnimalHusbandryService，Beijing100193，China； 4.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The objective of this study was to elucidate the characteristics in histomorphology and the potential molecular mechanisms underlying the dermal hyperpigmentation in Youzhou Dark-skin goat.First，we analyzed the characteristics of histomorphology in 100 d-fetal skin in Youzhou Dark-skin goat(dark skin) and Yudong White goat(normal skin).Then we examined the mRNA expression ofPax3，MitfandTyrin skin and B16 cells in the 2 breeds.The results showed that：1) There were significant differences in the skin pigmentation between breeds at fetus skin rapid development stage；2) The skin mRNA levels ofPax3 andTyrwere significantly higher in Youzhou Dark-skin goat than that in Yudong White goat(P<0.001)，whereas no significant difference was observed inMitfexpression between the 2 breeds(P>0.05)；3) The expression ofPax3 was decreased(P<0.001)，Tyrwas increased(P<0.01) during the B16 cell differentiation，as compared with the proliferating B16 cells.The results indicate that：1) There might be diversity in migration pathway of the dermal melanocytes between the dark-skin and normal skin goats during the early stage of skin development differentiation；2) Downregulation ofPax3 and upregulation ofTyrare indispensible for melanogenesis in melanocytes；3) The high expression ofPax3 andTyrare associated with the dermal hyperpigmentation in Youzhou Dark-skin goat.

Youzhou Dark-skin goat；dermal pigmentation；histomorphology；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.006

2015-03-04

重慶市基本科研業(yè)務(wù)費項目(2012cstc-jbky-00907；2014cstc-jbky-00106)；重慶市農(nóng)發(fā)資金項目(14412)

任航行(1974-)，男，陜西戶縣人，副研究員，博士，主要從事羊遺傳育種研究，E-mail：rhxe@163.com

*通信作者：周 鵬，副研究員，E-mail：cqzp2006@163.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2015)09-1525-07