劉會(huì)勝，趙戰(zhàn)勤*，薛 云，薛 巧 ，汪 洋 ，常世愷，劉 媛

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南省高等學(xué)校環(huán)境與畜產(chǎn)品安全重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003； 2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003)

羊源致病性弗氏檸檬酸桿菌的分離與鑒定

劉會(huì)勝1，趙戰(zhàn)勤1*，薛 云2，薛 巧1，汪 洋1，常世愷1，劉 媛1

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南省高等學(xué)校環(huán)境與畜產(chǎn)品安全重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003； 2.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng) 471003)

旨在確定導(dǎo)致河南省某養(yǎng)殖場(chǎng)小尾寒羊細(xì)菌性感染死亡的病原。從3只不同時(shí)間發(fā)病死亡的小尾寒羊各組織臟器的病料中分離到3株細(xì)菌——LK-1、LK-2和LK-3株。經(jīng)微生物自動(dòng)鑒定儀鑒定和細(xì)菌16S rRNA基因序列分析，確定該致病菌為弗氏檸檬酸桿菌。小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果表明：3株細(xì)菌的LD50分別為5.0×107、6.0×107和5.8×107CFU?；貧w試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)人工感染健康小尾寒羊，可復(fù)制與自然發(fā)病羊相似的癥狀和病理變化，且從其各組織臟器內(nèi)再次分離到相同的病原菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，3株弗氏檸檬酸桿菌對(duì)大部分藥物的抗藥譜相同(17/21)，且均對(duì)頭孢噻肟等11種藥物高度敏感。這些研究結(jié)果表明弗氏檸檬酸桿菌是該小尾寒羊致死性病例的病原菌。本文在國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道了弗氏檸檬酸桿菌對(duì)小尾寒羊具有致病性。

羊；弗氏檸檬酸桿菌；分離；藥敏試驗(yàn)；回歸試驗(yàn)

檸檬酸桿菌是腸桿菌科中的一種革蘭陰性細(xì)菌，是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，普遍分布在自然環(huán)境，如土壤、水、污水及食物中，是水體污染的重要細(xì)菌學(xué)指標(biāo)之一[1]。根據(jù)DNA雜交試驗(yàn)，檸檬酸桿菌可分為11個(gè)基因種。其中，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、科氏檸檬酸桿菌(C.koseri)和布氏檸檬酸桿菌(C.braakii)常與人和動(dòng)物的感染有關(guān)。在人類，該細(xì)菌主要引起呼吸道、泌尿生殖道以及消化道感染，尤其是在嬰兒、兒童及免疫功能不全的人體中，可引起腦膜炎、腦膿腫和新生兒敗血癥等[2]。近年來，檸檬酸桿菌已成為醫(yī)院感染的常見病原菌之一。根據(jù)2008年度數(shù)據(jù)報(bào)告，檸檬酸桿菌在臨床分離的腸桿菌中占第5位[3]。檸檬酸桿菌對(duì)動(dòng)物致病的重要性還未能確定。但是，近年來，該菌引起魚、鱉、蝦、大鯢、螈、 蟹等水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病[4-7]的報(bào)道較多。另外，腸外感染也可發(fā)生在實(shí)驗(yàn)小鼠、鳥類和爬行動(dòng)物中，而且它們的排泄物中攜帶檸檬酸桿菌[8]。但是，檸檬酸桿菌導(dǎo)致哺乳動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道很少。本研究首次發(fā)現(xiàn)弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致小尾寒羊感染發(fā)病的病例，且該病例中弗氏檸檬酸桿菌可以導(dǎo)致小尾寒羊發(fā)生敗血癥和急性死亡。本研究對(duì)該病原進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定并對(duì)其致病性進(jìn)行了初步研究，為該病的致病機(jī)制及其綜合防控技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例描述

2014年1月，河南省某規(guī)?；∥埠蝠B(yǎng)殖場(chǎng)，突發(fā)一種致死性傳染病。羔羊和成年羊均可發(fā)生，發(fā)病羊主要表現(xiàn)為體溫升高(41～42 ℃)、精神沉郁、食欲廢絕、喜臥，可視黏膜發(fā)紺，然后突然倒地，四肢震顫，發(fā)出痛苦低沉鳴叫聲，常于發(fā)病后8～24 h突然死亡，病死率100%(18/18)。對(duì)病死的4只羔羊和5只成年羊進(jìn)行系統(tǒng)剖檢，均呈現(xiàn)典型的敗血癥性病理變化。主要表現(xiàn)為腹腔有少量積液，肺、心肌嚴(yán)重出血，肝、脾腫大、出血，大、小腸均出血，腎出血，腦輕度水腫。

1.2 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar，TSA)和胰蛋白大豆肉湯(Tryptic Soy Broth，TSB)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司，四季青特級(jí)新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。生化鑒定管、藥敏紙片和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株(大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923)購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司?；蚪M提取試劑盒、TaqDNA聚合酶購(gòu)自上海SANGON公司；Bact-IST型全自動(dòng)微生物鑒定儀購(gòu)自珠海迪爾生物工程有限公司；PCR引物由上海SANGON公司合成。6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；3～4月齡、15～18 kg健康小尾寒羊購(gòu)自河南省洛陽(yáng)市散養(yǎng)農(nóng)戶。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

無菌采取發(fā)病羊的各臟器組織，涂布于含10%新生牛血清的TSA培養(yǎng)皿上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察，挑取單菌落進(jìn)行傳代純化和革蘭染色、鏡檢。

1.4 生化試驗(yàn)和微生物鑒定儀的鑒定

按生化管使用說明書對(duì)不同時(shí)間分離自3個(gè)病例的3株細(xì)菌(命名為L(zhǎng)K-1、LK-2和LK-3)進(jìn)行生化試驗(yàn)并判定結(jié)果。同時(shí)，按廠家使用說明書對(duì)分離的3株細(xì)菌進(jìn)行全自動(dòng)微生物鑒定儀的鑒定。

1.5 16S rRNA基因序列的擴(kuò)增和測(cè)定

1.5.1 PCR引物 用于16S rRNA基因序列擴(kuò)增的引物[9]為通用引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-ACGGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′。

1.5.2 PCR反應(yīng) 按試劑盒說明書分別提取LK-1、LK-2和LK-3株的基因組為PCR模板。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol·L-1MgCl22 μL，2 μmol·L-1dNTPs 1 μL，10 μg·m L-1上、下游引物各1 μL，2 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.5 μL，無菌水16 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min； 94 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s，25個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5.3 序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物由上海SANGON公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用BLAST在線生物學(xué)軟件(http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)分析。

1.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對(duì)LK-1、LK-2和LK-3株16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析，選取NCBI已報(bào)道的不同動(dòng)物來源弗氏檸檬酸桿菌的16S rRNA基因序列作為內(nèi)群；同時(shí)，選取檸檬酸桿菌屬的沃克曼檸檬酸桿菌、吉倫檸檬酸桿菌和塞氏檸檬酸桿菌，及埃希菌族的大腸桿菌、沙門菌、志賀菌，氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌作為外群。利用Clustal X2軟件[10]進(jìn)行多序列全局比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件[11]的Neighbour-joining方法和Kimura 2-parameter校正軟件進(jìn)行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過1 000次的自舉分析(Boostrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)。

1.7 藥敏試驗(yàn)和治療

按標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)對(duì)分離的3株細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[12]。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.8 小鼠毒力試驗(yàn)

取細(xì)菌LK-1株的純培養(yǎng)物接種于含10%新生牛血清的TSA平板上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落到含10%新生牛血清的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)12～16 h。使用無菌PBS將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行5倍比稀釋3個(gè)梯度。將20只BALB/c小鼠均分為5組(4只·組-1)，取上述原菌液及每個(gè)梯度稀釋菌液分別對(duì)一組BALB/c小鼠進(jìn)行腹腔接種(0.2 mL·只-1)。同時(shí)對(duì)原菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定接種的實(shí)際菌量。同時(shí)，設(shè)立1組4只小鼠接種無菌PBS為空白對(duì)照。觀察、記錄發(fā)病及死亡情況15 d，死亡者立即剖檢，取其內(nèi)臟和腦組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，并根據(jù)Reed-Muench法[13]計(jì)算LD50。按照同樣的方法對(duì)LK-2和LK-3株進(jìn)行小鼠LD50的測(cè)定。

1.9 羊回歸試驗(yàn)

[14]所述方法對(duì)小尾寒羊分別進(jìn)行靜脈和皮下途徑攻毒。將3～4月齡、15～18 kg小尾寒羊5只，分為3組(2只、2只、1只)。第1組2只通過耳靜脈接種[14]上述1.8中培養(yǎng)的LK-1株菌液2 mL(含活菌2.5×109CFU)。第2組2只通過頸部皮下接種[14]LK-1株菌液2 mL(含活菌2.5×109CFU)。第3組1只通過耳靜脈接種2 mL無菌PBS為對(duì)照。觀察、記錄發(fā)病及死亡情況至14 d，死亡者立即剖檢，取其內(nèi)臟和腦組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離情況

從發(fā)病死亡羊的各組織病料中均能分離出單一細(xì)菌，該細(xì)菌在含10%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后形成直徑2～3 mm，光滑、濕潤(rùn)、低凸、半透明、乳白色、有光澤、邊緣整齊的菌落。通過革蘭染色鏡檢，可見菌體直徑約1.0 μm、長(zhǎng)2.0～6.0 μm，直桿，單個(gè)或成對(duì)排列的革蘭陰性桿菌。與腸桿菌科的一般定義相符。對(duì)該羊場(chǎng)先后發(fā)病死亡的3個(gè)病例的細(xì)菌分離結(jié)果表明，在其心血、肺、肝、脾、腎、腦、小腸和淋巴結(jié)率均能分離到該細(xì)菌，這與發(fā)病死亡羊所呈現(xiàn)的敗血癥性病理變化相一致，也表明該細(xì)菌能導(dǎo)致羊發(fā)生嚴(yán)重的系統(tǒng)感染。

2.2 生化試驗(yàn)和全自動(dòng)微生物鑒定儀的鑒定

生化試驗(yàn)結(jié)果表明，3株分離細(xì)菌LK-1、LK-2和LK-3株的生化反應(yīng)譜是相同的，均為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、甘露糖、棉籽糖、山梨醇、β-半乳糖苷、尿素，硫化氫反應(yīng)陽(yáng)性。但是鳥氨酸脫羧酶、硝鹽酸還原、靛基質(zhì)和精氨酸脫氫酶反應(yīng)均為陰性。該生化反應(yīng)譜符合弗氏檸檬酸桿菌的生化特征。同時(shí)，對(duì)分離的3株細(xì)菌均進(jìn)行了全自動(dòng)微生物鑒定儀的鑒定。結(jié)果表明，LK-1、LK-2和LK-3株細(xì)菌經(jīng)微生物鑒定儀鑒定均為弗氏檸檬酸桿菌(可能性均超過99%)。微生物鑒定儀中的生化反應(yīng)項(xiàng)目的結(jié)果與人工操作的生化反應(yīng)管的結(jié)果一致。

2.3 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以LK-1、LK-2和LK-3株細(xì)菌的基因組為模板，使用通用引物PCR擴(kuò)增獲得了3個(gè)菌株的16S rRNA基因序列(1 450 bp，圖1)。序列比對(duì)結(jié)果表明，LK-1和LK-3株的16S rRNA基因序列(GenBank登錄號(hào)：KP068655)完全相同，兩者與LK-2株在第439位堿基處不同，由G變?yōu)锳。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)可以看出，LK-1株與日本弗氏檸檬酸桿菌NBRC16624株(魚肉分離株；GenBank登錄號(hào)AB681088.1)聚為一簇，且置信度達(dá)98%，表明兩者親緣關(guān)系最近。與其他動(dòng)物源弗氏檸檬酸桿菌的親緣關(guān)系依次是江蘇草魚源JS株(HQ399663)、湖北大鯢源JZ01株(JN831090)、上海鱘源HD0103株(JX483809.1)、江西中華鱉源LCJY-002株(KC691177)和安徽蝦源X120523株(KF156749.1)。

2.4 藥敏試驗(yàn)

從表1可以看出，3株弗氏檸檬酸桿菌LK-1、LK-2和LK-3株對(duì)大部分藥物的抗藥譜相同(17/21)，但3株細(xì)菌對(duì)阿莫西林、頭孢克洛、鏈霉素和阿奇霉素4種藥物的敏感性有明顯差異。3株細(xì)菌對(duì)頭孢噻肟等11種藥物均高度敏感，對(duì)青霉素G和紅霉素均耐藥。

M.DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.LK-1、LK-2、LK-3株細(xì)菌的PCR結(jié)果；4.空白(H2O)對(duì)照M.DL2000 marker；1-3.PCR product of LK-1，LK-2，LK-3 isolate，respectively；4.Negative control (H2O)圖1 LK-1、LK-2和LK-3株細(xì)菌16S rRNA基因的PCR結(jié)果Fig.1 The amplification of 16S rRNA gene fragement of LK-1，LK-2，LK-3 isolates

2.5 小鼠毒力試驗(yàn)

小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，空白對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀和死亡情況。三株弗氏檸檬酸桿菌LK-1、LK-2和LK-3株腹腔攻毒的小鼠表現(xiàn)精神萎靡，不食或采食減少。小鼠最早于攻毒后8 h開始死亡，死亡多發(fā)生在12～24 h，攻毒3 d(72 h)后小鼠停止死亡。死亡小鼠剖檢主要表現(xiàn)為敗血癥性病理變化。從死亡小鼠腦、心血、肺、肝、腸、淋巴結(jié)等組織均能分離到感染菌。根據(jù)Reed-Muench法[13]計(jì)算LK-1、LK-2和LK-3株的LD50分別為5.0×107、6.0×107和5.8×107CFU。

分支后的數(shù)字為GenBank登錄號(hào)，分支點(diǎn)上的數(shù)字為1 000次自舉分析(Boostrap)的置信度，0.01為1%的序列分歧度Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank.The number at each branch points is the percentage supported by bootstrap.Bar，1% sequence divergence圖2 LK-1株16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of Citrobacter freundii based on 16S rRNA gene sequence of LK-1 strain

2.6 羊回歸試驗(yàn)

通過耳靜脈接種弗氏檸檬酸桿菌LK-1株菌液的2只小尾寒羊(2.5×109CFU·只-1)，4 h后體溫均升高到41 ℃以上，精神抑郁、厭食、呼吸困難、喜臥，8 h后出現(xiàn)腹瀉，可視黏膜發(fā)紺，四肢震顫，臥地不起等癥狀；分別在接種后10和18 h死亡。通過頸部皮下接種弗氏檸檬酸桿菌LK-1株菌液的2只小尾寒羊(2.5×109CFU·只-1)，12 h內(nèi)體溫沒有明顯升高，但24 h后均升高到41 ℃以上，其他臨床癥狀與耳靜脈接種的羊相似，但發(fā)生過程比較緩慢；分別在接種3和5 d后死亡。接種無菌PBS的對(duì)照羊，在14 d的觀察期內(nèi)沒有出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀。發(fā)病死亡羊立即剖檢，可見典型的敗血癥性病理變化。主要表現(xiàn)為腹腔有積水，肺、心肌嚴(yán)重出血，肝出血，脾腫大、嚴(yán)重出血，淋巴結(jié)病變不明顯，大、小腸出血，腎出血，腦輕度水腫。從死亡羊的心、肝、脾、肺、腦、腸、淋巴結(jié)均能分離出與接種菌一致的細(xì)菌。

表1 弗氏檸檬酸桿菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Drug sensitivity of 3Citrobacterfreundiiisolates to 21 drugs

藥物名稱Drugs藥物含量/(μg·tablet-1)Slipcontent判定標(biāo)準(zhǔn)/mmStandardsofinhibitedhalo結(jié)果Resultsofsusceptibility耐藥R中敏I敏感SLK?1LK?2LK?3青霉素GPenicillinG10≤1414?15≥15R(9)R(12)R(8)氨芐西林Ampicillin10≤1314?16≥17I(15)I(16)I(16)阿莫西林Amoxicillin10≤1314?17≥18I(15)I(17)S(23)頭孢噻肟Cefotaxim30≤1415?22≥23S(23)S(31)S(34)頭孢拉定Cefradine30≤1415?17≥18I(15)I(17)I(17)頭孢克洛Cefaclor30≤1415?17≥18R(11)I(17)I(17)鏈霉素Streptomycin10≤1112?14≥15I(13)S(18)S(18)慶大霉素Gentamicin10≤1213?14≥15S(19)S(20)S(21)卡那霉素Kanamycin30≤1314?17≥18S(18)S(19)S(19)大觀霉素Spectinomycin100≤1415?17≥18S(19)S(20)S(21)四環(huán)素Tetracycline30≤1415?18≥19S(19)S(20)S(19)紅霉素Erythromycin15≤1314?22≥23R(8)R(11)R(10)阿奇霉素Azithromycin15≤1314?17≥18R(11)I(17)I(14)氯霉素Chloramphenicol30≤1213?17≥18S(18)S(19)S(20)多黏菌素BPolymyxinB200≤89?11≥12I(11)I(10)I(11)呋喃唑酮Furazolidone300≤1415?16≥17I(15)I(15)I(16)磺胺甲氧嘧啶Trimethoprim/Sulfamethoxazole23．75/1．25≤1011?15≥16S(22)S(22)S(21)諾氟沙星Norfloxacin10≤1213?16≥17S(30)S(27)S(33)恩諾沙星Enrofloxacin5≤1516?18≥19S(32)S(27)S(31)氧氟沙星Ofloxacin5≤1213?15≥16S(24)S(22)S(34)環(huán)丙沙星Ciprofloxacin5≤1516?20≥21S(34)S(34)S(38)

R.耐藥；I.中度敏感；S.高度敏感

R.Resistant；I.Moderate sensitive；S.Highly sensitive

3 討 論

檸檬酸桿菌是腸桿菌科的一屬革蘭陰性短桿菌，弗氏檸檬酸桿菌為檸檬酸桿菌屬中的模式種。近年來，該菌引起人與水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病[4-7]的報(bào)道較多。另外，感染也可發(fā)生在鳥類和爬行動(dòng)物[8]。但檸檬酸桿菌導(dǎo)致哺乳動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道很少。2000年王冬梅等報(bào)道了弗氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致人和仔豬食物中毒性腹瀉的病例[15]。2004年周勤等從腹瀉獼猴的肛拭子中分離到了1株弗氏檸檬酸桿菌[16]。2007年雷靜等從犢牛腹瀉病料中分離到2株弗氏檸檬酸桿菌[17]。2008年孫洋等報(bào)道該菌可導(dǎo)致東北虎的出血性腹瀉病[18]。但是，這些病例均是檸檬酸桿菌相關(guān)的腹瀉病例。本研究中，病羊表現(xiàn)為發(fā)病過程急且往往以死亡告終，剖檢可見以多系統(tǒng)出血為特征的敗血癥性病理變化，從各個(gè)組織臟器中均能分離到較純的弗氏檸檬酸桿菌，這表明該菌可以導(dǎo)致小尾寒羊發(fā)生嚴(yán)重的系統(tǒng)感染，而不僅局限于腸道感染。羊回歸試驗(yàn)結(jié)果也表明，經(jīng)人工感染健康小尾寒羊，可復(fù)制與自然發(fā)病羊相似的癥狀和病理變化，且從感染病羊各組織臟器中再次分離到相同的病原菌。

本研究對(duì)分離到的3株細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行了生化鑒定和全自動(dòng)微生物鑒定分析儀的鑒定，發(fā)現(xiàn)后者能對(duì)微生物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，顯著優(yōu)于常規(guī)的生化試驗(yàn)鑒定方法。本研究中，從3個(gè)死亡羊分離的LK-1、LK-2和LK-3株細(xì)菌經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定均為弗氏檸檬酸桿菌(可能性均超過99%)。進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，相比于中國(guó)的5個(gè)水產(chǎn)動(dòng)物分離株，LK-1株與日本魚肉源的NBRC16624株親緣關(guān)系更近，這可能暗示羊源LK-1株不是來源于我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物的跨種傳播。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的3株弗氏檸檬酸桿菌對(duì)大部分藥物的抗藥譜相同(17/21)，但對(duì)其中的4種藥物有明顯差異。3株細(xì)菌對(duì)頭孢噻肟等11種抗生素均高度敏感，臨床上可把這些藥物作為治療該病的首選藥物。雖然3株弗氏檸檬酸桿菌是同一發(fā)病群體分離的同種細(xì)菌，但其對(duì)阿莫西林、頭孢克洛、鏈霉素和阿奇霉素4種藥物的敏感性卻有明顯差別，這可能暗示著弗氏檸檬酸桿菌針對(duì)這些藥物能快速產(chǎn)生耐藥性。

近幾年，規(guī)?；B(yǎng)羊業(yè)迅速發(fā)展，但其疫病防控技術(shù)相對(duì)滯后，導(dǎo)致新發(fā)和再現(xiàn)性細(xì)菌傳染病的不斷出現(xiàn)和流行。本研究首次報(bào)道從小尾寒羊的致死性病例中分離到弗氏檸檬酸桿菌，并對(duì)其致病性和藥物敏感性進(jìn)行了初步探討，為該病的防治及快速診斷試劑和高效疫苗的研制、開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Isolation and Identification ofCitrobacterfreundiifrom the Diseased Small Tail Han Sheep

LIU Hui-sheng1，ZHAO Zhan-qin1*，XUE Yun2，XUE Qiao1， WANG Yang1，CHANG Shi-kai1，LIU Yuan1

(1.LabofVeterinaryMicrobiology，CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.LabofMedicalEngineering，CollegeofMedicalTechnologyandEngineering，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

To determine the pathogenic bacterium infecting the small tail Han Sheep，three strains，named LK-1，LK-2 and LK-3，were isolated from the heart，liver，spleen，lungs，kidney and intestines of three dead cases on a sheep farm in Henan province.Identification by the Biolog Microbial Identification System，and further 16S rRNA sequence and phylogenetic analysis demonstrated that the three isolates wereCitrobacterfreundii.Infection with the bacterial suspension to the healthy small tail Han Sheep could reproduce the diseased symptoms as occurred naturally and the same bacterium could be recovered from these infected sheep.Three isolates also have certain pathogenicity to the BALB/c mice，with the lethal doses of 5.0×107，6.0×107，5.8×107CFU，respectively.The susceptibility test to antibiotics demonstrated that three isolates LK-1，LK-2 and LK-3 were susceptible to 14 drugs，including cefotaxime，gentamicin，tetracycline，chloramphenicol，enrofloxacin，etc.Three isolates have similar antimicrobial resistance profiles to 17 of 21 drugs in this study.But they have different profiles to 4 drugs，including amoxicillin，cefaclor，streptomycin and azithromycin.In this study，we reported the pathogenicity on Small Tail Han sheep ofCitrobacterfreundiiat home and abroadfor the first time.Citrobacterfreundiiis the pathogen of the dead small tail Han Sheep cases.

sheep；Citrobacterfreundii；isolation；antibiotic susceptibility test；regression test

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.014

2015-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302106)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(132300410279)

劉會(huì)勝(1990-)，男，河南桐柏人，碩士生，主要從事動(dòng)物病原微生物學(xué)研究

*通信作者：趙戰(zhàn)勤，博士，副教授，E-mail：zhaozhanqin@126.com，Tel：0379-64282341

S852.612

A

0366-6964(2015)09-1593-07