張佳鳳，郝文波，肖 斌，廖小青，羅樹紅

抗弓形蟲水通道蛋白多肽抗體的制備及鑒定

張佳鳳，郝文波，肖 斌，廖小青，羅樹紅

目的 研制抗弓形蟲水通道蛋白(TgAQP)的特異性多肽抗體，并應(yīng)用于檢測弓形蟲ME49株中水通道蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。方法 根據(jù)TgAQP氨基酸序列設(shè)計B細(xì)胞抗原多肽，并將合成的多肽與KLH偶聯(lián)作為免疫原免疫新西蘭大耳白兔制備多克隆抗體，通過ELISA、Western blot和免疫熒光的方法對所得抗體進(jìn)行鑒定。結(jié)果 選定并合成抗原表位多肽,與KLH偶聯(lián)作為免疫原制備多克隆抗體；經(jīng)ELISA測定其多肽抗體效價達(dá)1∶40 000; Western blot表明制備的抗體能特異地識別天然弓形蟲中29.9 kDa處的條帶，與預(yù)測的TgAQP相對分子量大小相符；免疫熒光檢測到抗血清識別的蛋白定位于弓形蟲胞質(zhì)中。結(jié)論 制備了抗弓形蟲水通道蛋白多肽的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究弓形蟲水通道蛋白的生物學(xué)功能和代謝特點奠定了基礎(chǔ)。

弓形蟲；水通道蛋白；多肽抗體；亞細(xì)胞定位

水通道蛋白(Aquaporins,AQP)，亦稱水孔蛋白，自1992年Agre等[1]于紅細(xì)胞膜發(fā)現(xiàn)第一個水通道蛋白AQP1以來，目前在哺乳動物細(xì)胞膜上已發(fā)現(xiàn)13種[2]水通道蛋白，并分別介導(dǎo)不同類型細(xì)胞膜的跨膜水轉(zhuǎn)運。水通道蛋白是與水通透有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白[3]，廣泛存在于動物、植物及微生物中。剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii,Tg)水通道蛋白(TgAQP)屬于小分子疏水性內(nèi)在膜蛋白家族，可通過滲透壓梯度作用實現(xiàn)弓形蟲體內(nèi)水分子的跨膜運輸[4]?，F(xiàn)有研究表明弓形蟲AQP蛋白與植物TIP蛋白高度同源，均擁有參與水通道蛋白孔口形成的典型NPA基序[5],并與惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum,pf)的水通道蛋白亦均是一種水/甘油轉(zhuǎn)運通道[6]。水通道蛋白參與了許多重要的生理病理學(xué)過程，不僅與水的轉(zhuǎn)運相關(guān)，也是吸收和釋放葡萄糖及甘油等小分子溶質(zhì)所必需的轉(zhuǎn)運載體[7-9]。細(xì)胞毒性化合物如羥基脲和氫氧化銻可通過水通道蛋白進(jìn)入并殺死寄生蟲，TgAQP可能為弓形蟲病的診斷和治療提供新的靶標(biāo)[10]，具有重要的臨床意義。本研究通過人工設(shè)計并合成抗原表位多肽，將其偶聯(lián)載體蛋白作為免疫原制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究弓形蟲水通道蛋白的生物學(xué)功能和代謝特點提供有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 弓形蟲蟲株 弓形蟲蟲株選用首個已測序的剛地弓形蟲ME49株(II型蟲株)，由南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所保存。

1.1.2 主要試劑 合成多肽由廣州瑞博奧生物科技有限公司合成；馬來酰亞胺活化的BSA、KLH偶聯(lián)試劑盒(MBK1)、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；蛋白質(zhì)Marker購自Fermentas公司；PVDF膜購自Bio-Rad公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自Bioworld公司；DAPI購自碧云天；Alexa Fluor 488羊抗兔IgG購自Invitrogen。

1.1.3 實驗動物 健康25～30 g昆明小鼠(SPF級)及健康8周齡雄性新西蘭大耳白兔(SPF級)均由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 多肽的設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI中剛地弓形蟲與同源性高的惡性瘧原蟲[11]的水通道蛋白氨基酸序列，使用Immune Epitope Database(IEDB)軟件和BCPREDS Server 1.0軟件對TgAQP進(jìn)行B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測。再使用在線工具TMHMM Server v 2.0分析其跨膜區(qū)[12]，綜合SDSC Biology Workbench BOXSHADE方法得到的同源性比對結(jié)果，選取一段具有高度抗原性的非跨膜區(qū)保守序列。并委托廣州瑞博奧生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2 多肽的偶聯(lián)及免疫原的制備 使用MBK1試劑盒，通過馬來酰亞胺法將合成的多肽一部分與BSA偶聯(lián)制備包被原，另一部分與KLH偶聯(lián)制備免疫原，并將其溶于預(yù)先滅菌的PBS中,以等體積的比例分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑進(jìn)行充分乳化作為免疫原[13]。

1.2.3 多克隆抗體的制備 與弗氏完全佐劑乳化的免疫原按0.2 mg每只采用皮下多點注射方法免疫健康雄性新西蘭大耳白兔。按0.1 mg每只以弗氏不完全佐劑為乳化劑每兩周加強免疫1次；免疫3次后，用偶聯(lián)BSA多肽為包被原，間接ELISA測定抗體的效價>1∶40 000,繼續(xù)加強免疫2次后，測得效價>1∶80 000[14]。采用頸動脈放血并分離以獲得抗血清[15]。

1.2.4 多克隆抗體的純化 使用Protein-G親和層析法純化所得的抗血清：用結(jié)合緩沖液稀釋后于0.45 μm濾膜過濾，加樣到IgG親和層析柱，流速1 mL/min至基線，用洗脫緩沖液(100 mmol/L甘氨酸-HCl，pH 2.5)洗脫后，收集洗脫峰為純化的多克隆抗體，SDS-PAGE分析純化的效果[16]。

1.2.5 多克隆抗體效價測定 使用ELISA法檢測抗血清效價：每孔100 ng包被原于4 ℃包被過夜，次日1% BSA-PBS封閉1 h；加入倍比稀釋的抗血清作為一抗孵育2 h，同時以等體積免疫前兔血清和含5%脫脂奶粉的PBS作為陰性對照和空白對照。加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG作為二抗孵育1 h，TMB顯色。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處的吸光度值。

1.2.6 剛地弓形蟲速殖子的體內(nèi)培養(yǎng)及純化 將液氮內(nèi)凍存的剛地弓形蟲ME49株于37 ℃水浴復(fù)蘇，感染昆明鼠后7～10 d發(fā)病，于腹腔注射5 mL/只生理鹽水后回抽腹水的方法進(jìn)行弓形蟲的體內(nèi)培養(yǎng)。再以800 g離心10 min，棄上清，加生理鹽水洗滌沉淀3次后重懸純化剛地弓形蟲速殖子[17]。

1.2.7 Western blot檢測天然弓形蟲水通道蛋白 取剛地弓形蟲速殖子加入等體積2×Loading Buffer裂解，水浴煮沸10 min，離心取上清進(jìn)行Western blot分析。分別以免疫前收集的兔血清和純化的兔抗血清作為一抗孵育2 h。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗孵育1 h，ECL法顯色。

1.2.8 免疫熒光試驗分析TgAQP的亞細(xì)胞定位 取500 μL剛地弓形蟲速殖子涂布于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿孔中，于室溫晾干。加入4%多聚甲醛固定5 min，加入0.25% Triton X-100室溫透化10 min；用1% BSA PBST室溫封閉30 min；分別加入1∶1 000稀釋的兔多抗或免疫前兔血清作一抗室溫孵育1 h，加入用1∶1 000稀釋的Alexa Fluor 488羊抗兔IgG作二抗室溫避光孵育1.5 h，最后加入1∶1 000稀釋的DAPI染核10 min，PBS洗滌1次于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

2 結(jié) 果

2.1 B細(xì)胞線性表位預(yù)測 B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測結(jié)果如圖1所示：IEDB軟件選擇界值為0.350時顯示TgAQP存在6個B細(xì)胞線性表位，其中第7～27位氨基酸的抗原表位評分最高。BCPREDS Server 1.0軟件中BCPred Predictions方法得到3個表位評分中第8～23位氨基酸的抗原表位評分最高；而AAP Predictions方法得到8個表位評分中包括第9～24位氨基酸的7條多肽其抗原表位評分較高。綜合兩種工具的表位評分發(fā)現(xiàn)TgAQP蛋白包含第8～24位氨基酸的多肽其抗原評分均較高。

A:IEDB software; B:BCPREDS Server 1.0 software (b1:used the BCPred Predictions, b2:used AAP Predictions).

2.2 多肽的設(shè)計、合成及免疫原制備 其跨膜區(qū)及同源性比對結(jié)果如圖2所示：TMHMM軟件分析TgAQP蛋白含有6個跨膜區(qū)，而同源性比對結(jié)果中第9～19位氨基酸高度同源。最終設(shè)計多肽的氨基酸序列為：CGGSEGGGELGGDRERDS，后17個氨基酸來自于TgAQP第8～24位氨基酸殘基，N-端的C(半胱氨酸)為額外添加，以利于與載體蛋白的偶聯(lián)[18]。委托廣州瑞博奧生物科技有限公司合成多肽后偶聯(lián)載體蛋白，用等體積弗氏完全佐劑乳化制備免疫原。

A:the transmembrane structure of the TgAQP predicted by TMHMM software;

2.3 多克隆抗體的純化及效價 檢測兔抗抗血清純化后進(jìn)行SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3所示：制備抗血清的純化效果較好，在53 kDa處有1條特異性條帶，與抗體IgG重鏈的分子量相符；在22 kDa處有條帶，與抗體IgG輕鏈的分子量較為相符。

2.4 檢測多克隆抗體的效價及其對弓形蟲水通道

1:Protein marker; 2:Purified polyclonal antibody.

蛋白的識別 純化后抗血清抗體效價結(jié)果如圖4A所示：采用間接ELISA法測定純化后抗體效價達(dá)1∶40 000。將制備的多克隆抗體通過Western blot方法應(yīng)用于弓形蟲水通道蛋白的檢測，結(jié)果如圖4B所示：在29.9 kDa處有1條特異性條帶，與TgAQP預(yù)測的分子量相符。

2.5 免疫熒光試驗分析TgAQP的亞細(xì)胞定位 免疫熒光檢測TgAQP的亞細(xì)胞定位結(jié)果如圖5所示：通過激光共聚焦顯微鏡觀察可見，綠色熒光散在分布于剛地弓形蟲速殖子的胞質(zhì)中，Merge后與藍(lán)色熒光無重合；而使用免疫前兔血清的陰性對照的結(jié)果顯示無綠色熒光。結(jié)果說明了TgAQP散在分布于弓形蟲胞質(zhì)中，未見于胞核。

A:The titer of anti-TgAQP antibody was about 1∶40 000 by ELISA, the OD450 value of negative control is 0.047; B:Identification of TgAQP by Western-blot (1:Rabbit anti-TgAQP antibody; 2:The pre-immune serum of rabbit).

圖4 多克隆抗體效價的檢測及其對弓形蟲水通道蛋白的識別

Fig.4 Antibody titer of the purified polyclonal antibody and identification of TgAQP by Western-blot

A:The pre-immune serum of rabbit; B:Rabbit anti-TgAQP antibody. The bright field (BF) shows the form oftoxoplasmatachyzoite, and the green fluorescence is TgAQP, while DAPI displays the nucleus oftoxoplasma.

圖5 免疫熒光分析TgAQP在弓形蟲速殖子內(nèi)的亞細(xì)胞定位

Fig.5 Subcellular localization of TgAQP inT.gondiitachyzoites by immunofluorescence assays

3 討 論

自發(fā)現(xiàn)弓形蟲以來，由剛地弓形蟲引起人獸共患的弓形蟲病呈世界性分布，對公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害[19]。近年來，隨著器官移植、醫(yī)源性免疫移植和艾滋病患者的增多,弓形蟲病的發(fā)病率逐年呈現(xiàn)上升趨勢，因此開展對弓形蟲的研究、控制其感染和流行具有重要的意義[20]。目前弓形蟲病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜且缺乏特異的癥狀，臨床診斷使用的是血清免疫學(xué)方法[21]。同時，真正商品化的疫苗有Buxton等研發(fā)的用于綿羊免疫的疫苗，而適用于人的疫苗更為少見[22]。而弓形蟲水通道蛋白在細(xì)胞吸附、免疫調(diào)節(jié)以及毒力衰減方面有重要作用，這一功能對弓形蟲的生命活動至關(guān)重要[23]。為了解水通道蛋白在弓形蟲的入侵機制、毒力基礎(chǔ)、發(fā)育周期的作用，本實驗研制針對弓形蟲TgAQP的抗體，為深人研究TgAQP蛋白的生物學(xué)功能和代謝特點提供必要的試驗材料。

本研究制備蛋白多肽抗體的關(guān)鍵在于多肽片段的設(shè)計與選擇，通過軟件預(yù)測和分析蛋白的結(jié)構(gòu)特征與抗原表位，選擇三維結(jié)構(gòu)無法暴露且抗原性高的非跨膜區(qū)。通過與惡性瘧原蟲水通道蛋白同源性比較，選擇同源性較高、長度在15～40個氨基酸且具有穩(wěn)定構(gòu)象的B細(xì)胞線性表位[24]。與其他制備抗原的方法相比，人工合成多肽抗原具有以下優(yōu)點：避免菌體雜蛋白的污染；周期短；成本較低；操作簡單且應(yīng)用范圍廣[25]。免疫新西蘭大耳白兔獲得的多克隆抗體效價高達(dá)1∶40 000。Western-blot分析剛地弓形蟲合成的天然水通道蛋白可檢測到約29.9 kDa處的特異性條帶。間接免疫熒光分析TgAQP散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，未見于細(xì)胞核中。綜上所述,我們制備的兔抗TgAQP多克隆抗體具有與其抗原特異性結(jié)合的特征，并可應(yīng)用于免疫印跡和免疫熒光實驗,為深人研究弓形蟲水通道蛋白的生物學(xué)功能和代謝特點奠定基礎(chǔ)。

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中國人獸共患病學(xué)報

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Preparation and identification of anti-TgAQP peptide antibody

ZHANG Jia-feng,HAO Wen-bo,XIAO Bing,LIAO Xiao-qing,LUO Shu-hong

(InstituteofAntibodyEngineering,CollegeofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

In this study, we intended to prepare anti-Toxoplasmagondiiaquaporin (TgAQP) peptide antibody which was used to the application in the detection of the aquaporin expression and its subcellular localization ofToxoplasmagondii(T.gondii) ME49 strain. The B cell peptide antigen was designed based on the TgAQP amino acids sequence. After the peptide antigen was conjugated to the KLH, the fusion antigen was injected into New Zealand rabbits to prepare polyclonal antibody, followed by identification of ELISA, Western-blotting and immunofluorescence assays. The ELISA showed that the titer of anti-TgAQP antibody was about 1∶40 000. Western blotting revealed the specific affinity of the antigen to polyclonal antibody at 29.9 kDa proteinT.gondii. The protein detected by the indirect immunofluorescence assays was distributed in the cytoplasm of the parasite. Thus far, the anti-TgAQP polyclonal antibody was successfully prepared, providing a useful tool for further study of biological function and metabolic characteristics of TgAQP.

Toxoplasmagondii; aquaporin; peptide antibody; subcellular localization

Luo Shu-hong, Email:sluo815@gmail.com

國家自然科學(xué)基金(No.81171608)

羅樹紅,Email:sluo815@gmail.com

南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院抗體工程研究所，廣州 510515

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.002

R382.5

A

1002-2694(2015)10-0903-05

2015-04-08；

2015-07-31

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81171608)