蕭劍雄，王惠榕

福州市性病門診人群生殖道沙眼衣原體的分子流行病學(xué)研究

蕭劍雄，王惠榕

目的 探討福州市性病門診人群泌尿生殖道沙眼衣原體的基因型分布狀況。方法 收集2013-2014年臨床疑似生殖道沙眼衣原體感染者標(biāo)本2 019份，用實(shí)時熒光定量PCR檢測沙眼衣原體，陽性標(biāo)本用套式PCR擴(kuò)增Omp1區(qū)并進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果上傳至BLAST網(wǎng)站查找序列的相似性、構(gòu)建系統(tǒng)樹確定基因型。結(jié)果 檢測沙眼衣原體陽性標(biāo)本86份，成功分型的有83份，1株為混合感染。測得8個基因型，分別為：F型(36.59%)、E型(24.39%)、D型(12.20%)、G型(9.76%)、J型(9.76%)、H型(3.66%)、K型(2.44%)、B型(1.22%)。計算不同基因型間Omp1基因的核苷酸的同義突變率(dS)和非同義突變率(dN)，發(fā)現(xiàn)僅G型的dN/dS值大于1，其他型均小于1。結(jié)論 F型和E型是福州市性病門診人群泌尿生殖道沙眼衣原體的主要基因型。同義替代是Omp1基因在進(jìn)化過程中的主要變異。

生殖道沙眼衣原體；基因分型；分子流行病學(xué)

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2008年全球成人泌尿生殖道沙眼衣原體新發(fā)病例達(dá)1.057億。在發(fā)達(dá)國家生殖道沙眼衣原體感染的發(fā)病率已居于性傳播疾病的首位[1]。衣原體感染的發(fā)病率在我國有逐年增加的趨勢。通常衣原體感染的臨床癥狀較輕，病情隱匿，但遷延難愈，相當(dāng)一部分泌尿生殖道衣原體感染患者治療效果不好，容易反復(fù)發(fā)作，最終可引起男性尿道炎、前列腺炎、附睪炎、直腸炎甚至引起不育；女性尿道炎、陰道炎、子宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎和盆腔炎，甚至導(dǎo)致輸卵管性不孕、異位妊娠等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響人們的健康和生活質(zhì)量。衣原體的生殖道感染還可顯著增加HIV感染的危險性[2]，給社會造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)己成為危害公共健康的一大問題。

感染人的沙眼衣原體包括兩個生物學(xué)變種，一種為沙眼生物變種，感染柱狀上皮細(xì)胞。另一種為性病淋巴肉芽腫變種，主要感染淋巴組織。各變種根據(jù)主要外膜蛋白(MOMP)抗原性不同，利用針對MOMP的單克隆抗體，將沙眼衣原體分成19種血清型。包括:4個淋巴肉芽腫血清型(L1,L2,L2a,和L3)，15個沙眼生物型血清型(A到K，以及Ba、Da、Ia和Ja),其中A、B、Ba和C主要引起沙眼，而D到K則主要引起生殖道疾病，L1到L3引起性病性淋巴肉芽腫。目前，基因分型法已取代血清學(xué)分類法。在我國已有學(xué)者對廣州、上海、深圳、南京等地的沙眼衣原體的基因分布進(jìn)行了研究[3-6]，但福州地區(qū)的分布情況還未見報道。本研究的目的是了解福州地區(qū)性病門診人群生殖道沙眼衣原體的感染情況和基因分布，獲得沙眼衣原體流行病學(xué)的相關(guān)信息，為疾病的預(yù)防與控制提供背景資料。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2013年8月至2014年10月在福州市皮膚病防治院性病門診就診，臨床疑似生殖道沙眼衣原體感染患者。診療時記錄感染后有無宮頸或尿道異常分泌物、尿道刺痛、癢或灼熱感等癥狀體征。

1.2 標(biāo)本采集及保存 男性患者以男性采樣拭子插入尿道約3～4 cm，旋轉(zhuǎn)停留片刻后取出，女性患者先用無菌棉拭子擦去宮頸口外溢分泌物，然后用女性采樣拭子插入宮頸管內(nèi)約1～2 cm，滾動并停留30 s 取出。用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的沙眼衣原體(CT)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)檢測樣本，將陽性樣本凍存于-70 ℃冰箱備用。

1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA mini kit)；Premix EX TaqTM Version 2.0 DNA 聚合酶(附加反應(yīng)用緩沖液、dNTP混合液)購自寶生物工程大連有限公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；其他試劑為國產(chǎn)分析純。Biometra Tgradient PCR擴(kuò)增儀為Biometra公司產(chǎn)品；水平電泳儀及電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像儀為UVItec Limited公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 DNA提取 自-70℃冰箱中取出凍存的樣本，將樣本漂洗于1mL生理鹽水，12 000 r/min離心10 min，細(xì)胞沉淀用QIAamp DNA mini kit 試劑盒提取基因組DNA，保存于-20 ℃冰箱中。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)設(shè)計[7]合成內(nèi)外兩對引物，外引物序列上游為P1：5′-ATG AAA AAA CTC TTG-3′，下游為OMP2：5′-ACT GTA ACT GCG TAT TTG TCT G-3′；內(nèi)引物序列上游為MOMP87：5′-TGA ACC AAG CCT TAT GAT CGA CGG A-3′，下游為RVS1059：5′-GCA ATA CCG CAA GAT TTT CTA GAT TTC ATC-3′。擴(kuò)增長度約為990 bp。第一輪PCR反應(yīng)體系如下：PCR Premix 25 μL，引物P1和OMP2各5 μL(10 pmoL/L)，模板DNA 5 μL，反應(yīng)體系加滅菌蒸餾水至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環(huán)，最后末次延伸72 ℃ 7 min。取5 μL此PCR產(chǎn)物作模板,用內(nèi)引物擴(kuò)增, 第二輪擴(kuò)增條將退火溫度調(diào)整為60 ℃，余條件相同。兩輪反應(yīng)均設(shè)置水為陰性對照。PCR產(chǎn)物檢測用1×TAE制備1.5%瓊脂糖凝膠，其中含有1.0 μg/mL EB，將水平電泳儀電壓調(diào)整為100 V，電泳時間為30 min。

1.4.3 測序 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化后雙向測序。測序引物為內(nèi)引物。

1.4.4 進(jìn)化樹分析 應(yīng)用Seqman 軟件對已測序基因進(jìn)行拼接，采用Blastn和Blastx程序，將測得的CT Omp1基因序列與美國國立醫(yī)學(xué)圖書館NCBI主頁(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中的核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)CT參考株A/Sa1(M58938)、B/IU-1226(AF063208)、Ba/Apache 2(AF063194)、C/TW3(M17343)、D/B-120(X62918)、Da/TW-488(X62921)、E/Bour(X52557)、F/ICCal3(X52080)、G/UW57(AF063199)、H/Wash(X16007)、I/UW-12(AF063200)、Ia/IU-4168(AF063201、J/UW36(AF063202)、Ja/IU-A795(AF063203)、K/UW31(AF063204)、L1/440(M36533)、L2/434(M14738)、L3/404(X55700)進(jìn)行同源性分析。用Mega5軟件做進(jìn)化樹分析，以沙眼衣原體小鼠生物型MoPnT株(M64171)做外群。

2 結(jié) 果

2.1 檢測陽性率 2013年8月至2014年10月共收集臨床疑似生殖道沙眼衣原體感染者的標(biāo)本2 019份，實(shí)時熒光定量PCR檢測沙眼衣原體陽性標(biāo)本86份，陽性率為4.26%?；颊咂骄挲g為32.81±1.05歲。

2.2 Omp1基因分型結(jié)果 對實(shí)時熒光定量PCR陽性標(biāo)本，擴(kuò)增Omp1基因片段，有83份樣本得到擴(kuò)增，采用PCR產(chǎn)物直接測定法測定CT Omp1基因的核苷酸序列，將序列進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)其與各血清型參考株的同源性分型，共檢出8個基因型，分布如下：F型30株(36.59%)、E型20株(24.39%)、D型10株(12.20%)、G型8株(9.76%)、J型8株(9.76%)、H型3株(3.66%)、K型2株(2.44%)、B型1株(1.22%)，1株為混合感染不能確定其基因型。

2.3 Omp1基因進(jìn)化樹分析 同Millman K的研究結(jié)果[8]，本研究臨床菌株和參考株的Omp1基因的進(jìn)化樹也分為3個分支，即3個群：B群包括B、Ba、D、Da、E、L1、L2、L2a型；C群包括A、C、H、I、Ia、J、Ja、K、L3型；中間群包括F和G型。臨床株未見A、Ba、C、Da、I、Ia、Ja、L1、L2、L2a、L3型。見圖1。

圖1 基于生殖道沙眼衣原體Omp1基因構(gòu)建的進(jìn)化樹

Fig.1 Phylogenetic reconstructions for the Omp1 gene ofC.trachomatis

2.4 Omp1基因序列進(jìn)化距離分析 應(yīng)用Mega5軟件使用默認(rèn)參數(shù)，對前述獲得的Omp1基因的核酸序列按型別進(jìn)行遺傳距離分析，再分別計算dN和dS值以及dN/dS值，并據(jù)此分析該基因可能面對的環(huán)境選擇壓力狀況。由于B、H、K型別的菌株較少而不予計算。分析可見G型、D型、J型的平均進(jìn)化距離要大于F型和E型。其中G型的遺傳距離最大，而E型最小。見圖2。非同義替換的平均頻率dN范圍從0.000～0.482，同義替換的平均頻率dS范圍從0.000～0.625。僅有G型的dN/dS值大于1，其他型均小于1。

2.5 生殖道沙眼衣原體相關(guān)臨床癥狀的基因型分布 感染后的癥狀體征分為有宮頸或尿道異常分泌物、尿道刺痛、癢或灼熱感等相關(guān)臨床癥狀和無癥狀兩組，經(jīng)統(tǒng)計分析，患者是否有相關(guān)臨床表現(xiàn)在B群、C群及中間群間未見顯著差異(χ2=1.304，P>0.05)。見表1。50例男性中無癥狀感染者22例，占44.00%；32例女性中無癥狀感染者19例，占59.38%，女性無癥狀感染者所占比例雖高于男性，但并無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.845，P>0.05)。無論男性還是女性F型均為最常見的基因型，其次是E型。F型在男性中占34.00%，女性中占40.63%，E型在男性中占22.00%，女性中占28.13%。B群、C群及中間群在男女性患者中的分布幾率均等(χ2=0.006，P>0.05)。

圖2 生殖道沙眼衣原體基因型的平均進(jìn)化距離

Fig.2 Mean distance within each genotypes ofC.trachomatis

3 討 論

我們根據(jù)國內(nèi)外同類型研究將生殖道沙眼衣原體基因型依據(jù)地區(qū)流行程度分為：E、F型為主要流行型，D、G、H、J和K型為次要基因型，其他B、Ba、I、Ia和Ja為少見基因型(見表2)。本研究發(fā)現(xiàn)福州生殖道沙眼衣原體同國內(nèi)外其他地區(qū)報道的主要流行基因型一致以E、F型為主，表明沙眼衣原體的主要流行型別不存在地理分布的差異。但次要及少見基因型在不同國家或地區(qū)間的分布卻不盡相同。G型在美國、瑞典、冰島等國流行率較低[8，11-12]，而在我國的流行率卻較高。在美國Ia型取代I型流行[8]，而在其他地區(qū)無論是I型還是Ia型均極少見。H型在臺南和臺北的地理分布存在差異[10]。據(jù)推測[13]，可能由于E和F型自身的生物學(xué)優(yōu)勢增強(qiáng)其潛伏在宿主中的能力從而逃避宿主的免疫壓力，也可能由于存在特異的粘附素或毒力因子使得它們在結(jié)構(gòu)或功能上更有利于病原體的傳播，而使得它們成為全球最流行的基因型。

學(xué)校以校院合作為平臺，聘請行業(yè)、醫(yī)院專家與學(xué)校專業(yè)教師組建專業(yè)建設(shè)指導(dǎo)委員會，參與專業(yè)開發(fā)，提出專業(yè)建設(shè)規(guī)劃，確定重點(diǎn)專業(yè)和新專業(yè)的設(shè)置。2015年3月，學(xué)校與有關(guān)合作醫(yī)院共同調(diào)研后決定新增農(nóng)村醫(yī)學(xué)、中醫(yī)康復(fù)保健、中醫(yī)護(hù)理、眼視光技術(shù)4個專業(yè)，現(xiàn)已獲批準(zhǔn)。

對Omp1基因核酸測序發(fā)現(xiàn)G、D和J型的平均進(jìn)化距離要大于F和E型，說明是E、F型Omp1基因較穩(wěn)定，變異度要遠(yuǎn)低于其他型。從分子生物學(xué)層面證實(shí)了上述推測即E、F型具有不同與其他型的生物學(xué)特性。我們的研究也表明除G型外，其他型別dN/dS值均小于1，在進(jìn)化過程中大部分基因型的同義突變率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于非同義突變率，說明未受到外界明顯的選擇壓力的影響，Omp1基因突變?yōu)閮艋x擇突變。

表1 生殖道沙眼衣原體相關(guān)臨床癥狀的基因型分布

表2 國內(nèi)外性病門診者中生殖道沙眼衣原體基因型分布

由于E和F型大范圍流行，有學(xué)者認(rèn)為他們引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)較弱，臨床表現(xiàn)較輕，不易被檢出而更容易擴(kuò)散傳播[14]。但Batteiger 等認(rèn)為炎癥表現(xiàn)與血清型無關(guān)[15]，在我們的研究中，無論是男性或女性，沒有發(fā)現(xiàn)基因型和臨床體征存在聯(lián)系，沒有證據(jù)表明流行范圍廣的基因型，臨床表現(xiàn)較輕。

我們注意到研究過程中存在的局限性。首先，由于商業(yè)試劑盒檢測的是多拷貝質(zhì)粒，而用于基因分型的Omp1基因是單拷貝基因，擴(kuò)增的敏感性較低。因此，有可能實(shí)時熒光PCR檢測陽性的標(biāo)本，而在擴(kuò)增Omp1基因時有可能得到陰性結(jié)果。其次，用PCR產(chǎn)物直接測序的局限性在于不能識別混合基因型的序列圖譜，除非對PCR產(chǎn)物克隆測序。第三，基因型的分布可能會受到目標(biāo)人群樣本數(shù)的影響。

總之，E、F型為福州地區(qū)生殖道沙眼衣原體的優(yōu)勢基因型。這一發(fā)現(xiàn)可以完善福州地區(qū)生殖道沙眼衣原體監(jiān)測的基線數(shù)據(jù)，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

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Molecular epidemiology ofChlamydiatrachomatisin outpatients visiting STD clinics in Fuzhou, China

XIAO Jian-xiong,WANG Hui-rong

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

We investigated the distribution ofChlamydiatrachomatisgenotypes in the outpatients visiting STD clinics in Fuzhou City, China. Between 2013 and 2014, a total of 2 019 urethral or endocervical specimens from susceptible genitalC.trachomatisinfections were collected and detected by using real-time PCR assay kit. TheC.trachomatis-positive specimens were subsequently amplified with nested PCR for Omp1 region and analyzed by sequencing. Genotyping was performed by BLAST similarity search and phylogenetic tree analysis. Eighty-three of the 86C.trachomatis-positive specimens were successfully sequenced. Only one specimen was identified as multiple infection. Eight different genotypes were identified. The most prevalent was F (36.59%), followed by E (24.39%), D (12.20%), G (9.76%), J (9.76%), H (3.66%), K (2.44%) and B (1.22%). Synonymous mutation rate and non-synonymous mutation rate among Omp1 genes of different genotypes were calculated. All genotypes but G showed dN/dSvalues of<1. Genotypes F and E were commonest. Synonymous substitution was the major pattern of variation in the process of Omp1 gene evolution.

Chlamydiatrachomatis; genotyping; molecular epidemiology

Wang Hui-rong, Email:fjwhr@hotmail.com

王惠榕，EmaiL：fjwhr@hotmail.com

福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.011

R374

A

1002-2694(2015)10-0947-05

2015-04-14；

2015-06-23