廖卿宇，胡飛環(huán)，吳靜波，羅佩芳，王文敬，黎誠耀

羊布魯桿菌脂蛋白OMP19單克隆抗體制備與鑒定

廖卿宇1，胡飛環(huán)1，吳靜波2，羅佩芳1，王文敬1，黎誠耀1

目的 制備與鑒定羊布魯桿菌脂蛋白OMP19單克隆抗體，用于布菌感染免疫機制研究。方法 將OMP19基因連接入pET-30a(+)表達載體中，構(gòu)建pET-30a(+)/OMP19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌BL21(E3)，以不同濃度異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)表達，采用鎳金屬螯合親和層析(NI-NTA)純化；以布菌陽性血清檢測重組蛋白免疫反應(yīng)性，并利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，以天然OMP19蛋白及布菌外膜蛋白提取物(NMP)對制備的單克隆抗體進行Western Blot及酶免疫染色試驗(IEST)鑒定。結(jié)果 表達了OMP19蛋白，分子量約19 kDa，通過純化純度可達95%，Western Blot分析顯示蛋白具有良好的抗原性，并制備了OMP19抗原23株鼠源性單克隆抗體，鑒定結(jié)果顯示22(95.65%)株能與天然OMP19蛋白反應(yīng)，18(78.26%)株能與NMP反應(yīng)，其中IgG1(k)亞型占91.30%；4株能與羊種布魯氏菌菌涂片反應(yīng)。結(jié)論 成功制備具有良好抗原性的重組OMP19蛋白，篩選出識別天然蛋白的單克隆抗體，已初步應(yīng)用于布菌的檢測，為OMP19抗原B細胞表位的篩選奠定基礎(chǔ)。

布魯桿菌；OMP19；蛋白表達；單克隆抗體

布魯氏菌病(Brucellosis，布病)，是布魯桿菌(簡稱布菌)引起的急性或慢性傳染病，屬嚴重人獸共患傳染病。近年來，通過接觸帶菌動物造成羊、牛布魯桿菌病感染的病例大量增加，根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心公布數(shù)據(jù)，2013年布病發(fā)病人數(shù)比2008年增加57%，達43 486例，以每年10% 新增速度成為發(fā)病數(shù)增加最快的疾病之一[1]，而2014年發(fā)病人數(shù)已達57 222例(http://www.chinacdc.cn/tjsj/fdcrbbg/)，死亡2例，形勢極其嚴峻。

動物的檢驗檢疫是控制布病的有效手段，布菌的外膜包括脂多糖、外膜蛋白和磷脂層，其中外膜蛋白是布菌的主要免疫原和保護性抗原。根據(jù)分子量大小，已發(fā)現(xiàn)的外膜蛋白分為3類，OMP19屬于第I類脂蛋白[2-3]；研究指出OMP19是造成布菌免疫逃避以及持續(xù)性感染十分重要的一部分，本研究重組表達OMP19蛋白，分析其免疫原性，制備其單克隆抗體，為布菌感染免疫學(xué)機制研究和疫苗的開發(fā)奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 主要材料和試劑 大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、表達載體pET-30a、布菌膜蛋白混合物(NMP)和SP2/0骨髓瘤細胞為南方醫(yī)科大學(xué)輸血醫(yī)學(xué)系實驗室貯存；OMP19基因、羊布魯桿菌疫苗菌株63290由新疆石河子大學(xué)陳創(chuàng)夫教授惠贈；陽性血清為疫苗株接種后的免疫羊血清，陰性血清由北京疾病與預(yù)防控制中心購買所得；羊種布魯氏桿菌菌涂片由廣州市疾病預(yù)防控制中心提供。核酸電泳分子量標準DL2000、DL10000、pMD19-T Vector、T4 DNA連接酶、Taq DNA 聚合酶dNTP及DAB-H2O2(大連寶生物工程公司)；蛋白質(zhì)電泳分子量標準SM1811(Fermentas 公司)；Fast Star DNA聚合酶(Roche公司)；NdeⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(NEB公司)；質(zhì)粒小提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自(天根生化科技(北京)有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG & IgM抗體(Rockland公司)；Ni-NTA親和層析填料購自GE-Healthcare公司；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Hyclone公司；HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG 1450均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 試驗動物 3只BALB/c小鼠，SPF級，雌性，6～8周齡，體重15～25 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于南方醫(yī)院實驗動物中心。

2 方 法

2.1 目的基因的擴增和克隆 利用GenBank中提供的羊布菌OMP19基因序列，截除OMP19 N端24個氨基酸信號肽的基因序列的引物：5′-GGAATTCCATATGTGCCAGAGCTCCCG-3′，5′- CCGCTCGAGGCGCGACAGCGT -3′，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。以菌株63290基因組為模板，擴增條件94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min結(jié)束。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，割膠純化目的基因，用NdeⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶雙酶切，酶切后擴增產(chǎn)物和表達質(zhì)粒PET-30a在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，由上海英駿生物技術(shù)公司測序。

2.2 目的蛋白誘導(dǎo)表達與鑒定 將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取單克隆至3 mL含Kan+抗性LB中，37 ℃誘導(dǎo)表達，分別設(shè)5個IPTG濃度(為0.2、0.4 、0.6 、0.8 、1 mmol/L)。收菌后超聲破碎，SDS-PAGE分離鑒定誘導(dǎo)前后的菌體破碎上清和沉淀。

2.3 蛋白純化及Western-Blot鑒定 純化采用鎳金屬螯合親和層析(Ni-NTA)方法，將收集的菌破碎液上清經(jīng)Ni-NTA親和層析純化，100 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。收集純化后目的蛋白，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，陽性和陰性血清1∶1 000稀釋后作為一抗，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊抗體作為二抗，洗滌與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進行底物顯色。

2.4 動物免疫與測定 將濃縮后的重組OMP19蛋白(rOMP19)與弗氏完全佐劑按1∶1乳化后，皮下多點注射BALB/c小鼠3只，每只小鼠抗原接種劑量為100 μg，2周后將重組蛋白與弗氏不完全佐劑按1∶1乳化后皮下多點注射，每只小鼠抗原接種劑量為50 μg，兩周后間接ELISA法檢測血清抗體效價。若效價達1∶51 200以上時，融合前3 d經(jīng)腹腔注射50 μg抗原加強免疫。

2.5 雜交瘤細胞株的建立 無菌條件下取小鼠脾臟制成細胞懸液，在1 mL 50% PEG1450介導(dǎo)下，融合小鼠骨髓瘤SP2/0細胞與脾細胞 (1∶5)，融合后加入HAT RPMI1640選擇培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后取細胞上清液，用間接ELISA法篩選分泌抗omp19單克隆抗體的雜交瘤細胞株。陽性細胞株用有限稀釋法連續(xù)亞克隆3次后，獲得穩(wěn)定高分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

2.6 單克隆抗體免疫特性和亞型分析 將rOMP19和NMP分別按1∶1加入2×SDS上樣緩沖液，沸水浴煮10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清10 μL進行12% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，隨后與1∶3稀釋后的各株單抗的細胞上清分別孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；HRP標記的羊抗鼠IgG & IgM作為二抗孵育1 h，TBST洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影。以非相關(guān)病原HCV一株單抗(實驗室制備)作為陰性對照。另用鼠單克隆抗體快速分型試紙條 (Hycult Biotech Inc 或Sigma-Aldrich) 進行亞型鑒定。

2.7 酶免疫染色試驗鑒定單克隆抗體 3%過氧化氫處理菌涂片，0.01 mol/L pH7.4 PBS洗滌后滴加50 μL omp19單克隆抗體株細胞上清，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌后滴加PBS1∶10 000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG &IgM 50 μL，37 ℃孵育45 min。PBS洗滌后，滴加50 μL DAB-H2O2，避光顯色15 min，純水終止反應(yīng)；中性樹膠封片后油鏡下觀察。以菌體膨大，呈黃棕色至棕黑色判定為陽性結(jié)果；不顯色或僅呈淺黃色判定為陰性。以HCV NS3單克隆抗體作為對照。

3 結(jié) 果

3.1 目的基因的克隆和表達 成功擴增534 bp的目的條帶(圖1A)，與pET-30a雙酶切目的基因條帶大小符合(圖1B)，送測序后與GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中序列號為gb|CP002931.1|羊種布菌OMP19序列100%匹配。

(A) PCR products of OMP19 gene; 1:PCR products; 2:negative control;

(B) Double enzymes restriction identification; 1-3:XhoI,NdeI double enzymes restriction products.

圖1 OMP19基因擴增及表達載體雙酶切鑒定

Fig.1 PCR and double enzymes restriction identification

3.2 目的蛋白誘導(dǎo)表達與純化 經(jīng)SDS-PAGE分析，5個IPTG誘導(dǎo)表達情況相似，菌破碎上清電泳后在19 kDa左右有明顯條帶，與目的蛋白大小吻合，即重組OMP19以可溶性蛋白形式存在(圖2)。Ni-NTA純化后蛋白，在280 nm波長下測得濃度為5.5 mg/mL，經(jīng)SDS-PAGE分析，所得蛋白純度可達到95%左右(圖3A)。

3.3 rOMP19抗原性檢測 Western Blot檢測rOMP19與布菌陽性抗血清出現(xiàn)較強的反應(yīng)，陰性血清無反應(yīng)，證明蛋白有良好的抗原性(圖3B)。

M:Protein marker; 1-3:0.4,0.6, 1 mmol/L IPTG induced precipitation; 4:negative control before induction; 5-7:0.4,0.6, 1 mmol/L IPTG induced supernatant.

圖2 MP19蛋白表達SDS-PAGE電泳鑒定

Fig.2 SDS-PAGE analysis for OMP19 expression

M:Protein marker; A-1:Purified protein; A-2:negative control before induction; B-1:positive serum; B-2:negative serum.

圖3 rOMP19純度和免疫反應(yīng)性檢測

Fig.3 Analysis for purity and immunoreactivity of rOMP19

NC:anti-NS3 antibody;PC:positive serum

Fig.4 Detection of supernatants of hybridomas for monoclonal antibodies to rOMP19 by ELISA

3.4 OMP19單抗的制備 經(jīng)過1次細胞融合，以rOMP19為抗原，ELISA檢測雜交瘤上清共篩選出23株抗rOMP19單克隆抗體，包括3C4、4A1、4D4、5C8、5B1、6B5、5A1、6D2、4A11、6C8、1B5、4D12、4E3、6D12、4F7、3A1、4H2、6E7、2C2、6F4、5D6、5G10、6B8(圖4)。

3.5 單抗免疫特性和亞型分析 rOMP19和NMP分別與各株單抗(mAb)培養(yǎng)上清Western-Blot鑒定結(jié)果顯示，22(95.65%)株單抗能與rOMP19反應(yīng)(圖5A)，其中18(78.26%)株mAb能識別NMP，于19 kDa 大小處可見顯色帶(圖5B)。21株(91.30%)單抗亞型為IgG1(k)，1株(4.35%)為IgG2b (k)，1株(4.35%)為 IgM(k)。

(A) mAb reacted with rOMP19; (B) mAb reacted with NMP.

圖5 Western-Blot鑒定單抗免疫特性分析

Fig.5 Western Blot analysis

3.6 酶免疫染色試驗鑒定單克隆抗體 經(jīng)鑒定，6F4，6B8，3C4，5A1共4株omp19單克隆抗體培養(yǎng)上清能與羊種布魯氏菌菌涂片反應(yīng)。其中，6F4和6B8單抗上清與菌涂片反應(yīng)較強(圖6)。

圖6 酶免疫染色試驗鑒定單克隆抗體

4 討 論

要研究布魯氏菌外膜蛋白OMP19的抗原性和免疫原性，需要大量重組蛋白和抗OMP19單克隆抗體作為前提條件。本研究構(gòu)建的布魯氏菌表達的融合蛋白分子量約19 kDa，主要以可溶性蛋白形式存在，37 ℃條件下，不同IPTG濃度下目的蛋白表達量差別不大，利用鎳金屬螯合親和層析(Ni-NTA)方法純化后可得到>95%的高純度蛋白，經(jīng)陽性血清檢測顯示出良好的抗原性；利用雜交瘤技術(shù)成功制備出23株抗OMP19的單克隆抗體，其中21株能與變性的重組OMP19蛋白反應(yīng)，18株能與變性的天然OMP19抗原反應(yīng)，即極有可能為識別線性表位抗體。酶免疫染色試驗顯示布菌omp19單克隆抗體可與羊種布氏菌菌涂片反應(yīng)，提示該抗體可初步應(yīng)用于布氏菌抗原檢測，為進一步鑒定其B細胞表位，研究布菌感染的免疫學(xué)分子機制，以及研發(fā)布菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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Production and identification of monoclonal antibodies againstBrucellamelitensisU-lipoprotein OMP19

LIAO Qing-yu1,HU Fei-huan1,WU Jing-bo2,LUO Pei-fang1,LI Cheng-yao1,WAGN Wen-jing1

(1.DepartmentofTransfusionMedicine,SchoolofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2.ShaoguanColloge,Shaoguan512005,China)

We produced and identified the monoclonal antibodies againstBrucellamelitensisU-lipoprotein OMP19. A DNA fragment coding omp19 ofBrucellamelitensiswas amplified by PCR, and inserted into the vector of pET-30a(+), the resultant recombinant plasmid, which we designated as pET-30a(+)/omp19. We then transformed the plasmid into BL21(DE3) competent cells for the expression of the OMP19 protein. After induction with different concentrations of IPTG, the colleted cells were analyzed by SDS-PAGE, and then OMP19 monoclonal antibodies were prepared through hybridoma technology. These mAbs were tested to reactivity to rOMP19 and nature membrance proteins (NMP) ofBrucellamelitensisby Western blot and IEST. We successfully constructed an expression vector of pET30a(+)/omp19. An IPTG-induced expression of the OMP19 protein (19 kDa in molecular weight) was demonstrated by SDS-PAGE. The fusion protein existed in the form of soluble, and the OMP19 protein of high purity could be obtained by Ni-NTA. Western blot assay showed that the refolded protein could be recognized by the anti-serum againstBrucellamelitensis. Twenty-three mAbs to OMP19 was produced in which 91.30% were IgG1, twenty-two (95.65%) mAbs could recognize nature OMP19 protein, and eighteen (78.26%) mAbs could recognize NMP, four mAbs could react withBrucellamelitensis. The protein maintained good immunogenicity and twenty-three mAbs were obtained, which we believe provides a good protein candidate for the immunological research．

Brucella; OMP19; protein expression; monoclonal antibody

Wang Wen-jing, Email:wenjingking77@126.com

國家自然科學(xué)基金項目(31372443、31100657)；廣東省自然基金項目(2011B090400407)

王文敬，Email：wenjingking77@126.com

1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院輸血醫(yī)學(xué)系，廣州 510515； 2.韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，韶關(guān) 512005

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.001

R378.5

A

1002-2694(2015)10-0899-04

2015-03-15；

2015-08-03

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31372443 and 31100657), and the Guangdong Provincial Science and Technology Foundation (No. 2011B090400407)