聶 恒，王旭東，吳利先

大理地區(qū)合并HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌MLVA法基因分型研究

聶 恒，王旭東，吳利先

目的 探討MLVA基因分型法在云南大理地區(qū)合并HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌基因分型中的運(yùn)用，初步研究其基因型特征。方法 選取大理地區(qū)61株合并HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分別對(duì)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，應(yīng)用BioNumerics(6.6)軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果 共對(duì)61株合并HIV雙重感染者的結(jié)核分枝桿菌的15個(gè)VNTR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，呈現(xiàn)出明顯的基因多態(tài)性。各個(gè)位點(diǎn)的分辨能力不同，其中MIRU26(0.839)最高，MIRU4(0.341)最低。經(jīng)聚類(lèi)分析，61株雙重感染結(jié)核分枝桿菌菌株可分為5個(gè)基因群，61個(gè)基因型，以Ⅰ型占比例最大占51.6%(32/61)；H37Rv減毒株在Ⅱ型。結(jié)論 大理地區(qū)合并HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌VNTR基因存在明顯多態(tài)性，主要流行菌群為北京家族基因型。

結(jié)核分枝桿菌；基因分型；雙重感染；HIV；MLVA

結(jié)核病(Tuberculosis)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染引起的可以侵害全身多個(gè)器官臟器的慢性傳染病，其中以肺結(jié)核最為常見(jiàn)。自1921年卡介苗(BCG)的問(wèn)世和20世紀(jì)50年代以來(lái)有效的抗結(jié)核化學(xué)藥物的相繼問(wèn)世與應(yīng)用，結(jié)核病的肆虐與流行得到了一定的控制。但是自上世紀(jì)80年代末以來(lái)結(jié)核病的發(fā)病率呈現(xiàn)回升且逐年遞增的趨勢(shì)，形勢(shì)非常嚴(yán)峻。造成此種形式的一個(gè)主要原因是HIV在全世界范圍內(nèi)的流行和播散。有報(bào)道約有15%～30%的AIDS患者死于結(jié)核病。另?yè)?jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)每年的新發(fā)結(jié)核病人中約9%是由HIV感染所造成的。研究[1]發(fā)現(xiàn)AIDS患者的結(jié)核病發(fā)病率是正常人群的30倍。另?yè)?jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道約30%的AIDS死亡病例與結(jié)核病有關(guān)。云南是我國(guó)艾滋病和結(jié)核病的高發(fā)地區(qū)。本實(shí)驗(yàn)選取云南大理地區(qū)61株合并HIV雙重感染肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。根據(jù)文獻(xiàn)[2-5]報(bào)道和細(xì)菌基因庫(kù)的數(shù)據(jù)，本研究篩選了15個(gè)VNTR位點(diǎn)，應(yīng)用MLVA基因分型方法對(duì)雙感菌株進(jìn)行基因分型研究。探討這些位點(diǎn)的分辨能力，初步了解大理地區(qū)合并HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌基因分型特征及流行情況，為該地區(qū)合并HIV雙重感染者結(jié)核病的防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 61株HIV感染者肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌臨床分離株由大理州疾病預(yù)防控制中心提供；結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)減毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器 PCR試劑盒、100 bp DNA Mar(天根生化科技(北京)有限公司)、瓊脂、PCR儀、凝膠成像儀。

1.3 VNTR位點(diǎn)選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2-5]和細(xì)菌基因庫(kù)篩選15個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因位點(diǎn)。引物由北京天根生物科技有限公司合成。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 結(jié)核分枝桿菌DNA制備 將收集到的菌株接種于中性L-J培養(yǎng)基，37 ℃孵育培養(yǎng)4～6周，取生長(zhǎng)良好的菌落溶于500 μL TE(pH8.3)中；恒溫混勻儀100 ℃，30 min；離心12 000 r/min，10 min；取上清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管中即為DNA，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 VNTR-PCR 采用25 μL反應(yīng)體系：模板DNA 3 μL，上下游引物個(gè)1 μL，ddH2O 7.5 μL，Taq Mixture12.5 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、3 min；變性94 ℃、40 s，退火68.2℃、40 s，延伸72 ℃、40 s，35循環(huán)；延伸72 ℃、5 min；PCR產(chǎn)物置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳。在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，用100 bp Marker確定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小，以H37Rv減毒株作為對(duì)照。

1.4.4 計(jì)算分辨指數(shù) 計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)分辨指數(shù)(Hunter-Gaston，HGI)，計(jì)算公式[6-7]:

HGI=1-1/N(N-1)Σjs=1nj(nj-1)

N：總菌株數(shù)，s：獲得的基因總數(shù)，nj：j組中的菌株數(shù)

1.4.5 聚類(lèi)分析 將檢測(cè)菌株呈現(xiàn)的PCR擴(kuò)增指紋經(jīng)Quantity One軟件數(shù)字化，通過(guò)H37Rv減毒株進(jìn)行比對(duì)分析，進(jìn)一步確定每株菌株每個(gè)VNTR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)，并保存于Excel表中。用BioNumerics(6.6)軟件UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié) 果

2.1 檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性 每次實(shí)驗(yàn)設(shè)立的對(duì)照菌株H37Rv減毒株在同一VNTR位點(diǎn)的擴(kuò)增片段大小相同。從檢測(cè)樣本中隨機(jī)選取20個(gè)菌株，每株不同VNTR位點(diǎn)檢測(cè)3次，每次DNA擴(kuò)增片段大小形同。

（5）完善項(xiàng)目庫(kù)的建設(shè)。項(xiàng)目庫(kù)是預(yù)算管理的基礎(chǔ)和支撐，對(duì)項(xiàng)目庫(kù)實(shí)行常年開(kāi)放和滾動(dòng)管理。一是強(qiáng)化項(xiàng)目庫(kù)約束。未納入項(xiàng)目庫(kù)管理的項(xiàng)目，原則上不予安排預(yù)算資金。二是做好日常項(xiàng)目編報(bào)和管理。對(duì)于經(jīng)論證通過(guò)的項(xiàng)目，應(yīng)及時(shí)納入項(xiàng)目庫(kù)，成熟一個(gè)，編報(bào)一個(gè)，并依據(jù)“輕重緩急”排序。一旦學(xué)校有專(zhuān)項(xiàng)資金到達(dá)，財(cái)務(wù)部門(mén)就可以依據(jù)到達(dá)的資金額度和項(xiàng)目排序安排預(yù)算，改變以往臨時(shí)申報(bào)、評(píng)審、立項(xiàng)的做法，大大提高資金的下達(dá)效率。

2.2 VNTR多態(tài)性檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)共選取15個(gè)特異VNTR位點(diǎn)對(duì)大理地區(qū)61株合并HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示不同菌株的DNA指紋圖譜顯示出明顯的多態(tài)性。不同菌株在MIRU26和Mtub29位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

M:100 bp DNA maker; H:Standard strains H37Rv; s1-s30:Sample.

M:100 bp DNA maker; H:Standard strains H37Rv; s31-s45:Sample.

2.3 各位點(diǎn)分辨力 各個(gè)位點(diǎn)分分辨指數(shù)(HGI)詳見(jiàn)表1。VNTR位點(diǎn)的分辨力與HGI值成正比，本研究顯示15個(gè)位點(diǎn)的分辨力存在較大差異，15個(gè)VNTR位點(diǎn)當(dāng)中HGI指數(shù)最高為0.839，最低為0.341。根據(jù)Solac等[7]研究報(bào)告，不同VNTR位點(diǎn)的分辨力分為高、中和低3種，高分辨力HGI﹥0.7，中分辨力0.4≤HGI≦0.7，低分辨力HGI<0.4。據(jù)此本研究高分辨力位點(diǎn)有MIRU10、MIRU26、MIRU40、Mtub21、Mtub30、Mtub39、MIRU31、Mtub4；中分辨力位點(diǎn)有MIRU39、MIRU27、MIRU23、MIRU2；低分辨力的位點(diǎn)有ETR-B、Mtub29、MIRU4。

表1 15個(gè)VNTR位點(diǎn)HGI指數(shù)

Tab.1 Hunter-Gaston index of the fifty variable number tandem repeat

LocusHGILocusHGILocusHGIMIRU10Mtub21Mtub29MIRU4MIRU310.7450.7970.3520.3410.824MIRU26Mtub30MIRU39ETR-BMIRU230.8390.7800.6610.3870.622MIRU40Mtub39MIRU27MIRU2Mtub40.7460.7350.6930.6120.772

2.4 MLVA基因分型 采用Bionumerics(6.6)軟件，對(duì)61株雙重感染者臨床分離菌株的數(shù)字化信息進(jìn)行聚類(lèi)分析，生成相應(yīng)基因發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。根據(jù)UPGMA樹(shù)狀圖基因分型結(jié)果，大理地區(qū)61株合并HIV雙重感染者臨床肺結(jié)核分離菌株和1株標(biāo)準(zhǔn)株減毒株共分為5個(gè)基因群62個(gè)基因型，其中Ⅰ型占51.6%(32/62)，包括32個(gè)基因型；Ⅱ型占29.0%(18/62)包括18個(gè)基因型；Ⅲ型占11.3%(7/62),包括7個(gè)基因型；Ⅳ型占6.5%(4/62),包括4個(gè)基因型；Ⅴ型占1.6%(1/62),包括1個(gè)基因型。其中Ⅰ型為雙重感染者主要的流行基因型，H37Rv減毒株則在Ⅱ型。

2.5 北京家族基因型 將61株合并HIV雙重感染者結(jié)核分枝桿菌臨床分離株和1株H37Rv減毒株的15個(gè)特異VNTR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)與http：//www.miru-vntrplus.org網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中參比，對(duì)比得出菌株大致所屬種群。通過(guò)對(duì)比得出全61株合并HIV雙重感染者臨床分離株北京家族基因型占66%(40/61),非北京家族基因型占34%(21/61)；Ⅰ型菌株中北京家族基因型19株占59%，非北京家族基因型13株占41%。

圖3 61株雙重感染者結(jié)核分枝桿菌BioNumerics6.6聚類(lèi)分析圖(UPGMA)

Fig.3 Sixty-one combined disease strains ofM.tuberculosisBioNumericse 6.6 clustering analysis diagram

3 討 論

MLVA基因分型技術(shù)是結(jié)核病分子流行病學(xué)研究的重要工具，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)流行病學(xué)的不足。對(duì)結(jié)核病的爆發(fā)流行時(shí)檢測(cè)傳染源、檢測(cè)結(jié)核病的傳播、區(qū)別內(nèi)源性和外源性感染、分析某地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌基因型以及實(shí)驗(yàn)室污染等方面研究有著重要的意義[8]。

在MLVA基因分型中，VNTR位點(diǎn)的選擇尤為重要。本實(shí)驗(yàn)選取國(guó)際上推薦的15位點(diǎn)組合，結(jié)果顯示出明顯的遺傳多態(tài)性。每一特異VNTR位點(diǎn)多態(tài)性由其HGI值決定，所以本研究15位點(diǎn)多態(tài)性由低到高依次為MIRU4、Mtub29、ETR-B、MIRU2、MIRU23、MIRU39、MIRU27、Mtub39、MIRU10、MIRU40、Mtub4、Mtub30、Mtub21、MIRU31、MIRU26。其中前3個(gè)位點(diǎn)屬于低分辨力組但保守性高；分型過(guò)程中分型的差別主要是有高分辨力組的8個(gè)位點(diǎn)決定的，且此8個(gè)高分辨力位點(diǎn)對(duì)于基因的成簇性起著至關(guān)重要的作用；而中等分辨力組的4個(gè)位點(diǎn)主要作用是提高多位點(diǎn)聯(lián)合分析的穩(wěn)定性和精確基因群的分類(lèi)。研究中發(fā)現(xiàn)同一位點(diǎn)的分辨力的高低。

在不同研究中差異較大，這種結(jié)果可能與地域人和群差異有關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)選取的15位點(diǎn)組合總的HGI大于0.99，初步證實(shí)這一組合方案適用于該地區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型。

據(jù)之前的研究報(bào)道北京家族基因型結(jié)核分枝桿菌毒性高、傳播速度快且播散的范圍廣，所以在以后大理地區(qū)合并HIV雙重感染者的結(jié)核分枝桿菌研究中應(yīng)注重北京家族基因型的研究，找出特異性更高的遺傳標(biāo)記物，確保能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)控制；加大研究的范圍和樣本量更進(jìn)一步準(zhǔn)確的得出更為科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕Y(jié)論；由于不同VNTR位點(diǎn)的分辨力不同所以不同位點(diǎn)組合之間分辨也是有差別[10-11],且目前國(guó)際上沒(méi)有一更明確的組合標(biāo)準(zhǔn)，所以之后的研究應(yīng)增加不同的位點(diǎn)組合進(jìn)行對(duì)比分析找到真正適合于大理地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌基因分型位點(diǎn)組合。

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MLVA basedMycobacteriumtuberculosisclinical isolates genotyping analysis from HIV co-infection patients in Dali area, China

NIE Heng,WANG Xu-dong,WU Li-xian

(TeachingandResearchSectionofMicrobiologyandImmunology,DepartmentofBasicMedical,DaliUniversity,Dali671000,China)

A new method based on the multiple locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) was applied for the genotyping of combined HIVMycobacteriumtuberculosisin Dali to investigate the genotyping and distribution pattern ofMycobacteriumtuberculosisclinical isolates with MLVA.Mycobacteriumtuberculosisclinical isolates were selected from Dali area, and the polymorphism of VNTR locus was tested with PCR. The clustering of genotype was analyzed by BioNumerics(6.6). Result showed that 15 VNTR loci of 61 combined HIVMycobacteriumtuberculosisclinical isolates were analyzed respectively. There were obvious polymorphisms of VNTRs. The discrimination power of these loci appeared different from each other, with the biggest Hunter-Gaston index (0.839) loci was MIRU26, and the smallest one (0.341) loci was MIRU4. The clustering of genotype showed that these strains could be categorized into 5 gene clusters and 61 genotype, the proportions of cluster Ⅰ was the biggest one, 51.6% were cluster Ⅰ which including 32 strains. The standard strain H37Rv was belongs to cluster Ⅱ. Its indicated that there are obvious polymorphisms of VNTRs of combined HIVMycobacteriumtuberculosisclinical isolates in Dali. The main genotype was Beijing family genotype.

Mycobacteriumtuberculosis; genotype; c-infection; HIV; MLVA

Wu Li-xian, Email:w-lixian@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81260456)

吳利先，Email：w_lixian@163.com

大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，大理 671000

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.006

R378.91

A

1002-2694(2015)10-0923-04

2015-04-13；

2015-08-04

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81260456)