張麗君,田 軍,劉 永
(1.安徽中醫(yī)藥大學,安徽合肥 230012;
2.安徽省食品藥品檢驗研究院,安徽省中藥研究與開發(fā)重點實驗室,安徽合肥 230051)
痛經(jīng)貼劑由枳殼、陳皮、赤芍、當歸、延胡索、冰片等八味中藥組成,具有行氣止痛,活血化瘀的功效,用于治療氣滯血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)。本方中枳殼和陳皮同屬蕓香科植物,具有理氣作用,故作為君藥。柚皮苷、新橙皮苷為枳殼主要有效成分,橙皮苷為陳皮主要有效成分,且柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均屬黃酮類成分[1-3]。為有效控制痛經(jīng)貼劑的質(zhì)量,本實驗采用高效液相色譜法同時對柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷進行測定并進行了方法學考察,方法簡單、可靠、穩(wěn)定性好。
島津LC-10AT型高效液相色譜儀(單元泵,SPD紫外檢測器,島津 LC solution Lite色譜工作站);TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);As3120B型超聲波清洗器(北京恒奧德儀器儀表有限公司);METTLER TOLEDO XS105型電子天平(鄭州龍騰達儀器設(shè)備有限公司)。柚皮苷對照品(批號:110722-200108);橙皮苷對照品(批號:110721-200512);新橙皮苷對照品(批號:111857-201102)均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其它試劑均為分析純。痛經(jīng)貼劑,自制,批號分別為:20141218、20141226、20150112。
2.1 色譜條件 色譜柱:Cosmosil-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm × 250 mm);流動相:乙腈—0.1% 磷酸(21∶79);流速:1.0 mL · min-1;檢測波長:分別取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品液適量,在200~400 nm波長范圍內(nèi)掃描,并參考藥典,最終確定最大吸收波長為283 nm;柱溫:25℃;進樣量:10 μL。
2.2 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品適量,加甲醇制成每1 mL中含柚皮苷80μg、橙皮苷60μg、新橙皮苷60μg的混合溶液,即得混合對照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備 本品貼劑除去蓋襯,取約1 g,精密稱定,置錐形瓶中,加甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流1.5 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.4 空白溶液的制備 根據(jù)處方組成,取除枳殼和陳皮外的其余藥材,按制備工藝要求制備不含枳殼和陳皮的空白樣品,照“2.3”項下方法制備空白溶液,精密吸取10μL,按上述色譜條件進行測定,結(jié)果在柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷位置未見峰出現(xiàn),表明空白溶液對樣品測定無干擾。測定結(jié)果見圖1。
2.5 對照品精密度試驗 取“2.2”項下的混合對照品溶液,按上述色譜條件進行測定,連續(xù)進樣6次,結(jié)果柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積RSD分別為 1.035%、1.716%和 0.899%,表明本法對照品精密度良好。
2.6 線性范圍考察 精密稱取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品適量,加甲醇制成每1 mL中含柚皮苷 0.34 mg、橙皮苷 0.25 mg、新橙皮苷 0.26 mg的混合對照品溶液,采用等比稀釋法,即從10 mL上述對照品溶液中取5 mL,用甲醇定容至10 mL,再從10 mL中取5 mL用甲醇定容至10 mL,依次操作,分別得含柚皮苷 340、170、85、42.50、21.25、10.63 mg·L-1,橙皮苷 250、125、62.50、31.25、15.63、7.81 mg· L-1和新橙皮苷 260、130、65、32.50、16.25、8.13 mg·L-1的 6 份混合對照品溶液,按“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀進行測定,記錄峰面積。以對照品進樣量(μg)為橫坐標X,以峰面積為縱坐標Y進行線性回歸,得線性回歸方程:柚皮苷 Y=18 015X -23 049,r=0.999 9(n=6);橙皮苷 Y=19 172X -20 620,r=0.999 9(n=6);新橙皮苷 Y=20 985X -23 203,r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明:柚皮苷在 10.63 ~340 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,橙皮苷在7.81~250 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,新橙皮苷在8.13~260 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.7 供試品精密度試驗 取同一批號(批號:20141218)供試品,按“2.3”項下制備供試品溶液,再按“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,結(jié)果柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積RSD 分別為1.02%、1.29%和1.94%,表明本法供試品精密度良好。
2.8 重復(fù)性試驗 取同一批(批號20141218)痛經(jīng)貼劑樣品,按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備6份供試液,按“2.1”色譜條件注入液相色譜儀進行測定,并按外標法以峰面積計算含量,結(jié)果柚皮苷的含量為 6.09、6.05、5.97、5.81、5.89、5.97 mg·g-1,平均值為5.96 mg·g-1;橙皮苷的含量為5.23、5.14、5.1、5.14、5.01、5.06 mg·g-1,平均值為5.11 mg · g-1;新橙皮苷的含量為 3.76、3.72、3.66、3.85、3.8、3.82 mg·g-1,平均值為 3.77 mg·g-1。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的溶液含量的RSD分別為1.71%、1.48% 和 1.86%,表明本法重現(xiàn)性良好。
2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批(批號20141218)的供試品溶液,分別于 0、1、2、4、6、8 h,按“2.1”項下色譜條件測定,記錄其峰面積,結(jié)果柚皮苷的峰面積分別為 2 253 621、2 272 347、2 317 384、2 255 391、2 282 744、2 203 981,平均值為 2 264 245;橙皮苷的峰面積為2 143 612、2 160 111、2 155 815、2 086 990、2 202 010、2 127 881,平均值為 2 146 070;新橙皮苷的峰面積為 1 640 164、1 651 908、1 650 799、1 582 536、1 608 589、1 598 429,平均值為 1 622 071。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積RSD分別為1.65%、1.78% 和 1.83%。結(jié)果表明,供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.10 加樣回收率試驗 精密稱取除去蓋襯的同一批號已知含量的痛經(jīng)貼劑(批號20141218,柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量分別為5.86 mg·g-1、5.04 mg · g-1和3.68 mg · g-1)6 份,每份約0.5 g,置錐形瓶中,再分別加入柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷濃度分別為 0.312 4、0.263 2 和 0.185 8 mg·mL-1的對照品混合溶液10 mL,精密加入甲醇40 mL,稱定重量,加熱回流1.5 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,按“2.1”項下色譜條件進行測定,計算回收率。結(jié)果見表1~3。
表1 柚皮苷加樣回收率(n=6)
表2 橙皮苷加樣回收率(n=6)
表3 新橙皮苷加樣回收率(n=6)
2.11 樣品測定 取本品樣品 3批(批號:20141218,20141226,20150112),按“2.3”項下制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定,3批樣品中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量結(jié)果見表4。
表4 柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量測定結(jié)果
3.1 波長的選擇 藥典2010版一部枳殼、陳皮采用高效液相色譜法測定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量,測定波長均為283 nm,且采用紫外分光光度計在200~400 nm波長范圍內(nèi)掃描,結(jié)果顯示柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均在283 nm下有最大吸收,參考相關(guān)文獻[4-5],最終確定選擇283 nm為最大測定波長。
3.2 流動相的選擇 分別對甲醇—醋酸—水[6-8]和乙腈—0.1%磷酸[9-11]兩種流動相的不同比例進行了考察,結(jié)果甲醇—醋酸—水系統(tǒng)為流動相時橙皮苷峰形較寬,且新橙皮苷峰與雜質(zhì)峰分離效果較差,當甲醇—醋酸—水比例為(35∶1∶64)時,新橙皮苷峰分離效果較好,但出峰時間較長,而乙腈—0.1%磷酸系統(tǒng)為流動相時出峰時間短,峰形和分離度都較好,通過對其流動相不同比例進行比較,結(jié)果表明柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在乙腈—0.1%磷酸(21∶79)流動相下的峰形、分離度和出峰時間都較為理想,且空白對照無干擾。
3.3 提取方法的選擇 分別比較了用甲醇超聲提取[12-13]30、60 和90 min 及用甲醇加熱回流提取[14]30、60和90 min,根據(jù)柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量測定結(jié)果,最終確定用甲醇加熱回流提取90 min,可將這三種成分提取的比較完全。
3.4 柱溫的選擇 分別比較考察了20、25、30℃柱溫對柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷出峰時間及峰形的影響,結(jié)果表明25℃柱溫下效果最好,故選擇25℃作為柱溫。
3.5 色譜柱的選擇 本實驗分別考察了3種色譜柱 Cosmosil-C18(5 μm,4.6 mm ×250 mm)、Phenomenex-C18(5 μm,4.6 mm ×250 mm)、Welchrom-C18(5μm,4.6 mm ×250 mm)對樣品中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的分離效果,結(jié)果Welchrom-C18色譜柱分離度較差,Cosmosil-C18和Phenomenex-C18色譜柱的分離效果、峰形均良好,但Cosmosil-C18柱的出峰時間較早,故選擇Cosmosil-C18柱作為本實驗的色譜柱。
本實驗建立的HPLC法同時測定痛經(jīng)貼劑中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量方法,具有操作方便、準確可靠及重復(fù)性和穩(wěn)定性好的優(yōu)點,可作為痛經(jīng)貼劑的質(zhì)量控制方法。
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