劉曉鵬尚丹

作者單位: 050000石家莊市，北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站

常用分子生物學技術在食品病原微生物檢測中的應用

劉曉鵬尚丹

作者單位: 050000石家莊市，北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站

【關鍵詞】聚合酶鏈式反應;實時定量PCR;環(huán)介導等溫擴增法;基因芯片;酶聯(lián)免疫吸附

E-mail: 87553831@ qq.com

食品微生物檢測對于保障食品安全起著及其重要的作用。傳統(tǒng)的微生物檢測方法雖然有效，但存在檢測成本高、速度慢、效率低等問題，難以滿足現(xiàn)代社會快速檢測的要求。隨著細菌基因組學和分子生物學技術的飛速發(fā)展，誕生了許多分子生物學技術，它們因準確度和靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測周期短、效率高等優(yōu)點，越來越被廣泛應用。本文對在食品病原微生物檢測中常用的幾種分子生物學技術原理及應用作一綜述。

1　聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)

1.1PCR原理美國人Mullis于1985年發(fā)明了PC技術，并榮獲了1993年諾貝爾化學獎。PCR現(xiàn)在已成為生命科學領域最常用的分子生物學技術之一，它是一種體外酶促合成DNA片段方法，由變性、退火和延伸等幾步反應組成一個循環(huán)，重復進行，最終使目的DNA以指數(shù)級迅速擴增。

常規(guī)PCR反應體系中包括模板、引物、Taq DN聚合酶、dNTP、Mg2+及緩沖液等成分。PCR反應的原理類似于DNA的天然復制，其一輪循環(huán)過程如下(1)變性，即在93～95℃高溫下，是雙鏈DNA解離形成單鏈; (2)退火，即在合適的溫度下，引物與單鏈DNA模板的特異區(qū)域配對結合; (3)延伸，即在72℃下，Taq DNA聚合酶以引物的3’末端作為起始，以dNTP作為底物，按堿基互補配對原則，合成一條模板DNA鏈互補的新鏈。如此重復30個循環(huán)左右，目的基因就會被擴增一百萬倍以上。

PCR技術中，引物的設計質量起到至關重要作用。在使用軟件進行引物設計時，一般要遵循以下基本原則: (1)引物長度一般為18～30 nt; (2) GC含量為40%～60%，堿基盡可能隨機分布; (3)避免引物本身或引物之間形成發(fā)夾結構或引物二聚體; (4)引物3’端的堿基要求嚴格配對，3’末端盡量不要以A結尾。

與傳統(tǒng)的微生物檢測方法相比，PCR具有特點: (1)靈敏度高:病毒檢測的靈敏度可達3個RFU，細菌檢測的最小檢出率為3個細菌; (2)特異性強:對不同微生物型進行準確鑒定; (3)操作簡便省時:一般1～2 h就可完成檢測。

1.2常用PCR類型

1.2.1反轉錄PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) :核糖體廣泛分布于現(xiàn)存的所有生物，同種生物細胞中的rRNA序列保守性很強，可以利用rRNA堿基羞異進行菌株的分類鑒定。當需要對樣本中微生物的rRNA作為模板進行PCR檢測時，就需要用到RT-PCR。RT-PCR的基本過程:首先，提取檢測樣本中的總RNA;然后，采用隨機引物、Oligo (dT)或特異性引物，以RNA作為模板，在反轉錄酶反轉錄成雙鏈cDNA;最后，進行常規(guī)PCR。

1.2.2多重PCR(multiplex PCR) :多重PCR是在同一PCR反應管中同時加上多對病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增。其主要優(yōu)勢:①經(jīng)濟高效，在同一反應管內同時檢出多種病原微生物，大大的節(jié)省時間，節(jié)約經(jīng)費;②系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒、腸道致病性細菌、無芽胞厭氧菌等同時進行檢測。目前已在多種病原微生物的檢測中進行了應用: Kim等［1］采用多重PCR技術成功對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌等進行了檢測;蔡亦紅等［2］建立的多重PCR體系，成功對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌等3種食源性致病菌實現(xiàn)了檢測。

1.2.3實時定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qRT-PCR) : qRT-PCR是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針對PCR產物進行標記跟蹤，實時監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件對產物進行分析，準確計算目的基因的初始豐度。qRT-PCR除了常規(guī)PCR技術的特點外，還具有以下主要優(yōu)點:可以實時監(jiān)測，結果直觀;采用對數(shù)期分析，定量準確;無需凝膠電泳等后處理，減少對環(huán)境的污染。

最常用的qRT-PCR包括以下兩種類型:①SYB Green熒光染料法，此方法除了加入常規(guī)PCR反應成分外，另外加入SYBR Green熒光染料。SYBR Gree熒光染料摻入DNA雙鏈后，發(fā)出熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR Green染料分子不會產生熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步②TaqMan探針法，此方法除了加入常規(guī)PCR反應成分外，需要加入一條兩端分別標記報告熒光基團和淬滅基團的探針。探針完整時，報告基團發(fā)出的熒光信號被淬滅基團吸收; PCR擴增時，Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性將探針降解，使報告熒光基團和淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

陳蘇紅等［3］建立了檢測SARS病毒的qRT-PC方法，最低可檢測到5個拷貝的體外轉錄RNA分子特異性達100%。代娟等［4］針對編碼大腸埃希菌耐熱腸毒素I基因片段，采用MGB-TaqMan探針建立產耐熱腸毒素大腸埃希菌qRT-PCR檢測方法。徐德順等［5］以金黃色葡萄球菌FemB基因作為靶基因，建立食品中金黃色葡萄球菌污染的快速敏感特異的qRT PCR檢測方法。經(jīng)實驗證明，這些qRT-PCR檢測方法不僅靈敏性高、特異性好、檢測周期短、檢測結果準確穩(wěn)定，而且操作簡便，適應食品微生物檢驗發(fā)展的需要，具有較大的推廣及應用價值。

2　環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal ampli fication，LAMP)

LAMP是由Notomi等［6］開發(fā)出來的不同于PC的一種恒溫核酸擴增方法，其原理是基于靶基因的個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bs DNA polymerase)的催化下，等溫條件(65℃左右)保持幾十分鐘，即可完成核酸擴增，效率可達109～1010個數(shù)量級。在DNA合成時，從dNTP中釋放的焦磷酸根與Mg2+發(fā)生反應，產生白色的焦磷酸鎂沉淀。因此不需要繁瑣的電泳和紫外檢測，僅通過肉眼觀察白色渾濁度，就能判斷是否擴增。

Xu等［7］建立了快速檢測葡萄球菌的LAMP方法Song等［8］建立了檢測志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌的LAMP方法。Seki等［9］針對肺炎鏈球菌的lyt A基因序列，建立了LAMP檢測方法。通過對10株肺炎鏈球菌和6株非肺炎鏈球菌的檢測證明: LAMP法的特異性高，最低可檢測到10個拷貝的DNA，靈敏度達到PCR法的1 000倍，用時僅為1 h。LAMP操作簡單、快速、特異性強，不需要昂貴的儀器，不需要電泳及紫外觀察等，在食品微生物檢測中有著廣泛的應用前景。

3　基因芯片

基因芯片，又稱DNA微陣列(DNA microarray)，是20世紀90年代中期發(fā)展起來的一項分子生物學技術，是采用微加工技術將大量人工設計的基因片段有序的、緊密的排列固定于硅片等載體上構建而成的。通過與待測熒光標記樣品進行雜交，用熒光檢測系統(tǒng)對雜交后的芯片進行掃描，再通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而得出定性和定量的結果?；蛐酒夹g具有高通量、高自動化程度等特點，為全面、快速、準確地進行食品安全檢測提供了一個嶄新的平臺。

基因芯片已被成功用于多種病原體的檢測: Berger等［10］應用基因芯片技術對12株嗜酸乳桿菌進行了分析研究; Wang等［11］利用基因芯片技術為肺炎鏈球菌的監(jiān)測提供了一個新的具有更高特異性和靈敏度快速分析方法;高興等［12］探討隨機PCR結合基因芯片技術用于多種食源性致病菌篩查檢測的可行性，成功對痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、肉毒梭菌、肺炎鏈球菌、布氏桿菌、嗜肺軍團菌等16種病原細菌進行檢測篩查。但目前將基因芯片推廣應用還面臨諸多問題: (1)需要價格昂貴的儀器設備，芯片制備成本高，一般實驗室難以承擔其高昂的費用; (2)特異性有待提高，假陽性和假陰性仍影響結果的準確性; (3)尚未形成有效統(tǒng)一的制備、檢測和數(shù)據(jù)處理標準，在很大程度上影響芯片結果的可重復性。相信隨著芯片技術的不斷發(fā)展和完善，檢測操作方法的簡便化，儀器的小型化和低廉化，有望在未來廣泛應用于病原體檢測。

4　酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)

Engvall和Perlmannn于1971年首次報道了有關酶聯(lián)免疫吸附分析法用于IgG定量測定的技術。ELISA是以抗原和抗體的特異性結合反應為基礎，與酶對底物的高效催化作用相結合的一種高靈敏度試驗技術，根據(jù)酶作用于底物后的顯色反應，借助比色或熒光反應來分析。比較常用的ELISA方法包括雙抗體夾心法和間接法。ELISA檢測的操作步驟包括:先將抗原或抗體包被到載體表面，加入待檢標本與前者進行結合反應，然后再加入酶標記的抗原或抗體，最后加入酶反應的底物，生成有色產物，而產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色深淺進行定性或定量分析。ELISA建立在抗原抗體特異性結合的基礎上，因此該方法特異性強，同時酶促反應具有將抗原抗體反應信號放大的作用，因此靈敏度較高。

ELISA已被廣泛用于多種病原微生物的檢測Holzhauser等［13］用間接競爭EL ISA法成功地檢測出食品中含量低于2 mg/L的蛋白質。常婭莉等［14］針對于鼠疫菌rV抗原建立雙抗體夾心ELISA檢測方法對鼠疫菌檢測以及流行病學調查奠定了基礎。

食品安全是一個全球性重大公共衛(wèi)生問題，建立更靈敏、更有效、更可靠、更簡便的微生物檢測技術是保證食品安全的迫切需求和食品微生物檢測技術的發(fā)展趨勢。分子生物學技術以其快速、準確、靈敏的優(yōu)點逐漸成為微生物分類鑒定的主要手段，國外分子生物學技術在食品微生物檢驗中的應用研究已比較成熟國內由于各種條件的限制，目前實際應用并不多。

參考文獻

1Kim JS，Lee GG，Park JS，et al.A novel multiplex PCR assay for rapi and simultaneous detection of five pathogenic bacteria: Escherichia co O157: H7，Salmonella，Staphylococcus aureus，Listeria monocytogenes and Vibrio parahaemolyticus.J Food Prot，2007，70: 1656-1662.

2蔡亦紅，姚余有.3種食源性致病菌的多重PCR快速檢測方法的建立.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17: 1959-1962.

3陳蘇紅，張敏麗，黃堅.SARS冠狀病毒實時熒光RT-PCR定量檢測生物化學與生物物理進展，2004，31: 249-254.

4代娟，李玉峰，袁粒星，等.MGB-TaqMan探針實時熒光定量在快速檢測產腸毒素大腸桿菌中的價值.中華預防醫(yī)學雜志，2008，42: 103 106.

5徐德順，韓健康，吳曉芳.實時熒光定量-聚合酶鏈反應檢測食品中黃色葡萄球菌方法的研究.疾病監(jiān)測，2009，24: 541-544.

6Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal am plification of DNA.Nucleic Acids Res，2000，28: E63.

7Xu Z，Li L，Chu J，et al.Development and application of loop-mediatedi sothermal amplification assays on rapid detection of various types staphylococci strains.Food Res Int，2012，47: 166-173.

8Song T，Toma C，Nakasone N，et al.Sensitive and rapid detection of Shi gella and enteroinvasive Escherichia coli by a loop-mediated isotherm amplification method.FEMS Microbiol Lett，2005，43: 259-263.

9Seki M，Yamashita Y，Torigoe H，et al.Loop-mediated isothermal amplifi cation method targeting the lytA gene for detection of Streptococcus pneu moniae.J Clin Microbiol，2005，43: 1581-1586.

10Berger B，Pridmore RD，Barretto C，et al.Similarity and differences i the Lactobacillus acidophilus group identified by polyphasic analysis an comparative genomics.J Bacteriol，2007，189: 1311-1321.

11Wang Q，Wang M，Kong F，et al.Development of a DNA microarray toi dentify the Streptococcus pneumoniae serotypes contained in the 23 valent pneumococcal polysaccharide vaccine and closely related sero types.J Microbiol Methods，2007，68: 128-136.

12高興，曲險峰，孫偉，等.多種食源性致病菌的基因芯片檢測技術解放軍醫(yī)學雜志，2012，37: 765-769.

13Holzhauser T，Vieths S.Indirect competitive ELISA for determination traces of peanut (Arachis hypogaea L.) protein in complex food matri ces.J Agric Food Chem，1999，47: 603-611.

14常婭莉，焦磊，魏東，等.鼠疫耶爾森菌rV抗原單抗系統(tǒng)及其ELIS檢測方法的建立.微生物學免疫學進展，2012，22: 13-18.

(收稿日期:2014－11－25

通訊作者:尚丹，050000石家莊市，北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.041

【文章編號】1002－7386(2015) 09－1391－03

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 117