陳定虎+何春梅++蘇斐+馮黎霞+熊仁廣+鄭傳發(fā)+陳文聰+劉運(yùn)+方騰奎

摘 要：針對(duì)我國(guó)檢疫性植物病毒即李痘病毒主要6個(gè)株系設(shè)計(jì)了6個(gè)特異性探針，同時(shí)設(shè)計(jì)了擴(kuò)增該6個(gè)株系的一對(duì)通用引物，并確定了靶基因的PCR擴(kuò)增體系和芯片雜交體系。對(duì)6個(gè)探針核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明探針之間的同源性只有39-61%，而各探針與本株系的同源性達(dá)到95%以上，因此適合作為檢測(cè)李痘病毒主要株系的探針。成功設(shè)計(jì)的李痘病毒各主要株系的通用引物能夠一次性擴(kuò)增6個(gè)株系中的任何一個(gè)株系，而不需要做多重PCR，標(biāo)記的擴(kuò)增片段即可同芯片進(jìn)行雜交，不但可以檢測(cè)出李痘病毒，而且還能夠明確是該病毒的哪個(gè)株系，檢測(cè)結(jié)果直觀明了，易于判定。芯片特異性好，能夠正確區(qū)分6個(gè)株系，而且與其他植物病毒沒有交叉反應(yīng)。芯片的靈敏度高，可達(dá)到5pg/μL DNA模板濃度。

關(guān)鍵詞：基因芯片；李痘病毒；主要株系；檢測(cè)

李痘病毒（Plum pox virus， PPV）是我國(guó)2007年頒布的進(jìn)境植物檢疫性有害生物，是核果類果樹危險(xiǎn)性最大的病毒之一，屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）中的馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），其自然寄主主要是李屬的木本植物，侵染李、杏、桃、櫻桃等核果類果樹后，使葉片和果實(shí)均受到嚴(yán)重危害，未成熟果實(shí)大量脫落，造成果實(shí)品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低。病毒遠(yuǎn)距離擴(kuò)散則主要靠感染病毒的植物繁殖材料的調(diào)運(yùn)。根據(jù)病毒的來源和侵染植物的不同，該病毒的目前主要株系有6個(gè)，它們分別為PPV-D， PPV-M，PPV-C， PPV-EA， PPV-W，PPV-Rec，其中D株系和M株系是目前最主要的流行株系。

由于植物病毒的特殊性，即一般種子和苗木帶毒率是非常低的，加上進(jìn)出境量通常非常之多，如果抽樣量過少，則漏檢的機(jī)率就一定非常之大，把關(guān)作用就會(huì)大大消弱；為了最大限度的提高檢測(cè)率，避免漏檢，就必須加大抽樣量，這樣就會(huì)導(dǎo)致樣品眾多，不僅會(huì)加大檢測(cè)的工作量，而且會(huì)極大的影響檢測(cè)速度，推遲通關(guān)速度，進(jìn)而影響進(jìn)出境貿(mào)易的正常進(jìn)行，因此急需具有高通量檢測(cè)的儀器設(shè)備和方法，而基因芯片技術(shù)正好適合這一要求。

基因芯片（gene chip）的最早是80年代中期由Dulbecco首次提出且目前已經(jīng)在許多方面得到了廣泛的應(yīng)用[1，2，3，4]，其本質(zhì)上仍然是核酸分子雜交方法，具體系指將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。基因芯片技術(shù)由于同時(shí)將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測(cè)效率低等不足；而且，通過設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測(cè)定、實(shí)變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖及雜交測(cè)序等。

目前基因芯片技術(shù)已經(jīng)在許多方面得到了廣泛的應(yīng)用，但是在李痘病毒主要不同株系檢測(cè)鑒定方面還未見諸報(bào)道，本項(xiàng)目預(yù)期達(dá)到的最終目標(biāo)是研制出一次同時(shí)能夠高通量檢測(cè)李痘病毒主要株系的基因芯片和檢測(cè)方法。

1 研究材料

1.1 李痘病毒毒株來源

1.1.1 D（Dideron）株系： Tey （X16415）、PENN2（AF401296）、Fan （AY912056）、Rankovic （M21847）、Skiernevice（S73776）。

1.1.2 M（Marcus）株系： SK68（M92280）、PS （AJ243957）、06 （S57405）、S57404（1768bp）。

1.1.3 EA（El Amar）株系：X56258，AM157175。

1.1.4 C（Cheery）株系：Y09851、AY184478、X97398。

1.1.5 W（Winona） 株系：AY912055。

1.1.6 Rec （Recombinants between D and M） 株系：AY028309。

以上株系均購(gòu)自美國(guó)GADIA公司，其標(biāo)準(zhǔn)序列來自NCBI，括號(hào)中為其核酸序列登陸號(hào)。

1.2 芯片雜交材料

1.2.1 醛基載玻片：購(gòu)自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 探針：本實(shí)驗(yàn)探針是人工合成的，長(zhǎng)度41bp，并在合成的寡聚核苷酸探針末端（5'端）帶上氨基修飾，這種探針需要點(diǎn)制在醛基基片上。

1.2.3 點(diǎn)樣液：購(gòu)自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司；點(diǎn)樣液的目的是使點(diǎn)出的點(diǎn)圓潤(rùn)均勻。

1.2.4 雜交液：購(gòu)自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司。

1.2.5 洗液1：500ML： 量取440ml蒸餾水倒入1000ml試劑瓶中，加入50ml 20XSSC，混勻，再加入10ml 10%SDS，混勻，室溫儲(chǔ)藏。

1.2.6 洗液2：500ML： 量取495ml蒸餾水倒入1000ml試劑瓶中，加入5ml 20XSSC，混勻，室溫儲(chǔ)藏。

1.2.7 梯度PCR儀，Peltier Thermal Cycler 220：MJ Research，USA。

1.2.8 凝膠成像分析系統(tǒng)：Hema，德國(guó)。

1.2.9 核酸濃度測(cè)定儀，ND-1000 Spectrophotometer：NanoDrop Technologies Inc.，USA。

1.2.10 核酸干燥儀，DNA120 SpeedVac System：Thermo Speed

Vac，USA。

1.2.11 晶芯PersonalArrayer 16TM個(gè)人點(diǎn)樣儀、CapitalBio Corporation 雜交儀、LuxScanTM10K掃描儀、芯片盒，載玻片盒等均由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

2 研究方法

2.1 李痘病毒主要株系探針設(shè)計(jì)

采用軟件DNAStar 6.0的序列比較功能Meglign軟件對(duì)六種株系內(nèi)和株系間的序列進(jìn)行比較，特別是針對(duì)外殼蛋白編碼的基因序列進(jìn)行比對(duì)，找出其共同部分和特異部分，并對(duì)特異序列在NCBI中進(jìn)行核酸Blast搜索（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），以便設(shè)計(jì)出PCR擴(kuò)增的通用引物，并用通用引物對(duì)六個(gè)株系分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)通用引物的實(shí)用性和特異性。

2.2 六株系PCR擴(kuò)增的特異性通用引物設(shè)計(jì)及檢測(cè)

2.2.1 六株系PCR擴(kuò)增的特異性通用引物設(shè)計(jì)

對(duì)以上六株系序列進(jìn)行多序列比較，設(shè)計(jì)出了PCR擴(kuò)增這六個(gè)株系的通用特異性引物：

上游引物：PPV-chip-P1：5'- CCCATTTTCAC（G/A）CCAGCA（A/G）C -3'

下游引物：PPV-chip-P2：5'- TCGCATGATCCAACAATGGC -3'

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：508bp.

2.2.2 通用引物檢測(cè)

（1）感病植物總RNA提取

根據(jù)廣州普博生物技術(shù)公司提供的方法，稱取0.1g 感病植物組織，然后按照Trizol試劑盒方法提取其總RNA。

（2）反轉(zhuǎn)錄

在裝有去離子水9.5？滋L的0.2mL PCR管中，加入上步提取的總RNA 2？滋L，Oligo（dT）15 0.5？滋L（0.5ug）， dNTPs（10？滋mol/L）1uL，混合均勻，70℃水浴 5min后立即置于冰上2min，3000rpm離心30秒后加入5×cDNA第一鏈合成緩沖液4？滋L，0.1mol/L DTT 1？滋L，RNase 抑制劑 1？滋L（30U），M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1？滋L（20U），40℃水浴60min。

（3）PCR 擴(kuò)增

通用引物PCR 擴(kuò)增：在0.2mL PCR管中，加入10×PCR擴(kuò)增緩沖液2.5？滋L， dNTPs（10mmol/L）1？滋L，通用引物PPV-chip-P1 1 ？滋mol/L，PPV-chip-P2 1 ？滋mol/L，反轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)液2？滋L，加水至25？滋L，Taq 聚合酶 0.5？滋L（2.5U）；94℃ 3分鐘；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，循環(huán)35次；72℃ 10min；4℃保存。

雜交用PCR擴(kuò)增：此時(shí)PCR擴(kuò)增用的引物5'末端用熒光染料HEX進(jìn)行標(biāo)記，即：在0.2mL PCR管中，加入10×PCR擴(kuò)增緩沖液2.5？滋L， dNTPs（10mmol/L）1？滋L，通用引物PPV-chip-P1（Cy3 標(biāo)記） 1 ？滋mol/L，PPV-chip-P2（Cy3 標(biāo)記） 1 ？滋mol/L，反轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)液2？滋L，加水至25？滋L，Taq 聚合酶 0.5？滋L（2.5U）；94℃ 3分鐘；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，循環(huán)35次；72℃ 10min；4℃保存。這樣擴(kuò)增產(chǎn)物都會(huì)被標(biāo)記上HEX熒光素，以便用于雜交反應(yīng)。

（4）電泳分析

用1XTAE緩沖液配置1%的瓊脂糖凝膠，然后對(duì)5？滋L PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。一般而言，引物的擴(kuò)增長(zhǎng)度設(shè)計(jì)在300～1000bp之間，適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增長(zhǎng)度，可以保證有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，但是過長(zhǎng)的靶基因，會(huì)加大它與探針雜交的空間位阻，同時(shí)也更容易產(chǎn)生非特異性雜交或與擁有部分相同序列的同種病毒其他株系的交叉雜交。本實(shí)驗(yàn)PCR片段長(zhǎng)度是508bp，長(zhǎng)度大小和通用性及特異性都能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 基因芯片點(diǎn)樣

取5ul純化探針，加點(diǎn)樣液（100% DMSO，其中含1：100000的Cy3-dCTP）5ul混勻，探針濃度為10？滋m；然后加到晶芯PersonalArrayer 16TM個(gè)人點(diǎn)樣儀的384孔板上，每孔加40μL，將寡核苷酸探針點(diǎn)在醛基玻片上，并通過探針5'末端的氨基基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)固定。

2.4 陣列設(shè)計(jì)

陣列排布示意圖如圖1所示，點(diǎn)與點(diǎn)的中心距離為740μm，點(diǎn)的直徑為500μm，樣品包括探針、陽(yáng)性對(duì)照（定位基因）、陰性對(duì)照（DMSO）及空白對(duì)照（三蒸水），每個(gè)樣品點(diǎn)20個(gè)重復(fù)點(diǎn)，每塊玻片點(diǎn)兩個(gè)重復(fù)陣列。

陰性對(duì)照是用50%的DMSO，陽(yáng)性對(duì)照是標(biāo)記有熒光染料HEX的λDNA，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的作用是確認(rèn)芯片質(zhì)量合格及反應(yīng)條件正常與否，以保證反應(yīng)結(jié)果的有效性。正常情況下陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)該有熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照則沒有熒光信號(hào)。另外陽(yáng)性對(duì)照還起到一個(gè)位置標(biāo)志的作用，讓實(shí)驗(yàn)者可以方便的找到各個(gè)株系探針的位置。

2.5 芯片預(yù)處理

預(yù)處理的目的就是通過紫外光的照射（紫外交聯(lián)），使基因芯片上的核酸探針與基片牢固地結(jié)合在一起，以便與樣品雜交。點(diǎn)樣儀中干燥好芯片于65℃烘箱中固定1h，將芯片點(diǎn)有DNA的一面在60℃水浴鍋上水合10s，芯片距水面距離2-3cm，在空氣中室溫自然干燥后，再進(jìn)行一次水合。之后將點(diǎn)有探針的一面朝上，放在紫外交聯(lián)儀中250mJ交聯(lián)，后再將芯片放在42℃預(yù)熱的0.5% SDS中洗滌10min（42℃條件下水浴搖床80rpm），再用42℃預(yù)熱的蒸餾水清洗4min，最后用無水乙醇清洗2min。2000rpm離心5min去除芯片表面的液體后，密封，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 芯片的雜交

制備好芯片放置在北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的專用雜交盒中。

10uL雜交液的配制：100%甲酰胺 5uL，10% SDS 0.2uL，20 X SSC 1.5uL，PCR樣品標(biāo)記物3.3uL。（以不含標(biāo)記樣品的水做參照）。將標(biāo)記樣品與雜交液的混合物混勻后，3000rpm，離心30s，于95℃沸水中變性處理3min，冰浴驟冷1min，然后用移液器將雜交混合液分別加注到雜交芯片的蓋片上的小孔中，使預(yù)雜交液覆蓋于點(diǎn)樣區(qū)，然后蓋緊雜交盒的蓋，放入42℃的水浴中，雜交2h，使樣品與探針充分混合。

2.7 芯片的清洗

雜交結(jié)束后，在暗室內(nèi)取出芯片，雜交面朝上放于清洗盒中，放在水平搖床上用42℃預(yù)熱洗液1清洗4min，以便洗去沒有與探針特異性結(jié)合的樣品；然后迅速地用鑷子將芯片轉(zhuǎn)移到盛放有洗液2的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上用42℃預(yù)熱洗液1清洗4min。清洗結(jié)束后，1500rpm，1min離心干燥，除去玻璃表面上的液體，在4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行掃描。

2.8 芯片的掃描分析

利用基因芯片激光共聚焦掃描儀LuxScanTM10K掃描儀掃讀芯片信息，先打開掃描軟件是LUXSCAN 3.0，然后開倉(cāng)，將芯片插入機(jī)器內(nèi)，關(guān)倉(cāng)，使用綠色熒光通道，先使用4偽彩進(jìn)行預(yù)掃一次，以便選擇掃描區(qū)域，再進(jìn)行精掃，掃描參數(shù)為掃描分辯率為10μm，激發(fā)光源波長(zhǎng)532nm，接收的熒光信號(hào)中心波長(zhǎng)570nm，檢測(cè)靈敏度小于一個(gè)熒光分子/um2，激光功率值（Laser Power）100%，光電倍增管效率值（PMT Gain）600。

2.9 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定

掃描后圖像將通過判讀軟件（CapitalBio）自動(dòng)進(jìn)行分析，通過比較分析信號(hào)中位值和信號(hào)平均值的輸出數(shù)據(jù)，以其中最能反應(yīng)本試驗(yàn)芯片雜交圖像信息的參數(shù)值進(jìn)行結(jié)果分析。當(dāng)芯片上呈現(xiàn)綠色信號(hào)且HEX質(zhì)控信號(hào)呈現(xiàn)綠色信號(hào)時(shí)即可判定陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)于反應(yīng)強(qiáng)烈的可以直接從掃描圖片上熒光的反應(yīng)判斷檢測(cè)結(jié)果。

2.10 芯片的特異性試驗(yàn)

將PPV不同的株系PCR標(biāo)記擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分別與制備好的芯片進(jìn)行雜交，以檢測(cè)芯片的特異性。

2.11 芯片的靈敏性試驗(yàn)

靈敏度實(shí)驗(yàn)是指基因芯片所能檢測(cè)的最低DNA濃度，取決于目的基因制備時(shí)PCR擴(kuò)增的靈敏度。本試驗(yàn)將D株系的標(biāo)記PCR擴(kuò)增后的DNA稀釋成以下濃度：20pg/μL、10pg/μL、5pg/μL及2.5pg/μL，再與雜交液混勻后與檢測(cè)芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)熒光掃描儀掃讀信號(hào)，驗(yàn)證檢測(cè)芯片的靈敏度。

2.12 應(yīng)用芯片對(duì)植物病毒的驗(yàn)證檢測(cè)

用同樣是果樹上非常重要的病毒同時(shí)也是我國(guó)重要的進(jìn)境檢疫性病毒即李壞死環(huán)斑病毒做驗(yàn)證試驗(yàn)材料，采用與李痘病毒樣品處理相同的方法，提取其總RNA，設(shè)計(jì)其PCR擴(kuò)增引物并進(jìn)行5'端標(biāo)記：PNRSV1：5'-gatggtttgccgaatttgcaatc-3'， 下游引物PNRSV2：5'-ctagatctcaagcaggtcct-3'，然后做反轉(zhuǎn)錄RT，再用熒光標(biāo)記的特異性引物做PCR擴(kuò)增， 反應(yīng)條件：94℃ 變性3min，然后94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min，最后再與李痘病毒的芯片進(jìn)行雜交。

3 結(jié)果與分析

3.1 PPV六種株系PCR鑒定

經(jīng)過對(duì)PPV六種株系的序列進(jìn)行比對(duì)，找出了這六個(gè)株系的特性的保守片段，并設(shè)計(jì)了檢測(cè)它們的通用引物，本實(shí)驗(yàn)PCR片段長(zhǎng)度是508bp，長(zhǎng)度大小和通用性及特異性都能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求，電泳結(jié)果顯示用通用PCR引物能擴(kuò)增出個(gè)株系的特異性DNA片段，如圖2，為制備標(biāo)記靶基因奠定了基礎(chǔ)。

3.2 探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)序列比對(duì)，最后設(shè)計(jì)各株系特異性探針長(zhǎng)度都是41bp，序列分別如下：5'- 3'；探針濃度的測(cè)定值如表1所示，其A260：A280比值都超過1.8，純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

PPV-D-X16415.1-CP：

C A A C A A A A C C A G T T T C A C A G G T G C C A G G A C C T C A A C T G C A A

PPV-M-AJ243957.1-CP：

C G G T A A G A C C A G T T C C T C C A A T T T C A G G G A C C A A A C C G C G G

PPV-EA-X56258-CP：

C C A C T A G G A C A G T G C C T C A C A C A A C A A C T A C T A C A C C T C C T

PPV-Rec-AY028309-CP：

C G A T A A G A C C A G T T T C T C C A A T T T C A G G G G C C A C A C C G C A G

PPV-W-AY912055-CP：

G C G T G A A G C C A A C T A C A T C A G C A A C A A T T A A C C C A A C G T C T

PPV-C-Y09851-CP：

A T G T G A G A C C G A T T G C A C C A G T A G T G A C A A G T C C A T T C T C G

通過對(duì)檢測(cè)靶基因即PCR產(chǎn)物的同源性分析，能夠評(píng)價(jià)一個(gè)基因是否適合用于檢測(cè)某一種病毒，同時(shí)也為雜交反應(yīng)提供理論依據(jù)，是一個(gè)重要的指標(biāo)。探針的選擇是構(gòu)建檢測(cè)芯片最核心的內(nèi)容之一。作為檢測(cè)探針，必須根據(jù)探針在屬或種內(nèi)保守性及特異性的兩大原則來設(shè)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各個(gè)探針與同株系PCR產(chǎn)物即靶標(biāo)之間的同源性達(dá)到95%以上，而與非同株系的靶標(biāo)之間的同源性只有39-61%，這樣就確保了檢測(cè)靶基因間不會(huì)產(chǎn)生交叉雜交現(xiàn)象，保證了實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)特異性。同源性分析結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所選用的6個(gè)DNA序列片段適合用作構(gòu)建檢測(cè)李痘病毒6個(gè)主要株系的基因芯片的探針。

3.3 芯片的特異性雜交試驗(yàn)

將PPV不同的株系PCR標(biāo)記擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分別與制備好的芯片進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示每個(gè)株系的探針只與其相同株系的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，并顯示出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，而與其他株系的PCR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物沒有任何反應(yīng)，熒光暗淡。此雜交結(jié)果表明，檢測(cè)芯片具有良好的特異性，且雜交信號(hào)強(qiáng)度好，掃描圖像上雜交斑點(diǎn)明顯，檢測(cè)結(jié)果目視即可判定，有利于應(yīng)用該芯片對(duì)植物樣品中該病毒進(jìn)行檢測(cè)，如圖3-8。

3.4 芯片的靈敏性試驗(yàn)

將D株系的標(biāo)記PCR擴(kuò)增后的DNA稀釋成不同的濃度后雜交表明在模板DNA濃度在5～20pg/μL范圍內(nèi)，都有明顯的雜交信號(hào)，雜交斑點(diǎn)明顯；模板DNA濃度為2.5pg/μL時(shí)，無雜交信號(hào)，SNR為0.40，信號(hào)值小于100，肉眼看不到雜交斑點(diǎn)，表明檢測(cè)芯片的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到5pg/μL。如圖9所示。

3.5 芯片的特異性試驗(yàn)

首先用同樣為木本植物的檢疫性病毒即李壞死環(huán)斑病毒進(jìn)行驗(yàn)證，用PNRSV的熒光標(biāo)記的特異性引物做RT-PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出675bp的特異性片段，結(jié)果如下圖10所示，然后將擴(kuò)增的標(biāo)記產(chǎn)物與PPV芯片雜交，結(jié)果顯示PPV芯片除了陽(yáng)性質(zhì)控出現(xiàn)強(qiáng)烈熒光外，并不能與李壞死環(huán)斑病毒的擴(kuò)增物雜交上，如圖11.表明PPV芯片具有一定的特異性。

M：100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；

1. PNRSV及PPV二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2. PPV PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（243bp）

3. PVRSV PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（675bp）

4 討論

特異性探針的設(shè)計(jì)是基因芯片檢測(cè)技術(shù)的核心內(nèi)容，芯片中所用的探針為核酸分子探針，是指特定的已知序列的核酸片段，能與互補(bǔ)核酸序列發(fā)生雜交。因此可以利用探針檢測(cè)樣品中特定基因的特征片段或測(cè)定未知基因的序列。根據(jù)核酸分子探針的來源及其性質(zhì)可以分為基因組DNA探針、CDNA探針、RNA探針及寡核苷酸探針等?？梢愿鶕?jù)檢測(cè)對(duì)象和要求的不同選用不同類型的探針。但并不是任意一段核酸片段均可作為探針。探針選擇正確與否，將會(huì)直接影響到雜交結(jié)果的分析。探針選擇最基本的原則是應(yīng)具有高度特異性，兼而考慮來源及制備的方便等因素。本實(shí)驗(yàn)是通過核酸序列比對(duì)從李痘病毒外殼蛋白編碼基因的種的保守序列中尋找株系的核酸序列的特異性，并基于此設(shè)計(jì)出了6個(gè)株系的特異性探針，通過序列再比較并在NCBI中通過BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)這6條探針具有高度的特異性，完全可以作為株系探針來檢測(cè)和區(qū)分李痘病毒不同株系。

芯片基片的選擇非常重要，各種各樣的芯片表面修飾中，目前最常用的具有活性氨基或活性醛基基團(tuán)修飾。氨基化芯片適用于點(diǎn)制PCR產(chǎn)物、cDNA和蛋白質(zhì)等大分子，表面的氨基在中性的條件下帶正電荷，與DNA骨架上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過靜電相互作用相結(jié)合，這種結(jié)合方式與靶基因的序列組成和空間排列沒有關(guān)系。在一般的實(shí)驗(yàn)條件下，氨基基片均能表現(xiàn)出較低的自發(fā)熒光和低的背景熒光，但是對(duì)于比較短DNA片段如40bp左右的寡核苷酸，由于片段比較短小，為了其有更好的雜交效率，一般要對(duì)其進(jìn)行氨基修飾，并點(diǎn)在醛基基片更為合適，由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針都只有41bp，故本實(shí)驗(yàn)選用醛基基片，并對(duì)探針的5'端進(jìn)行氨基修飾，以便使氨基與醛基包被的基片結(jié)合，從而將探針固定在基片上。

芯片雜交的特異性取決于選取靶基因的同源性。本研究中所選取的靶基因均為同種病毒內(nèi)保守序列，但探針相互之間的同源性在39-61%以下，確保在雜交過程中不出現(xiàn)交叉雜交的現(xiàn)象。

對(duì)于一種檢測(cè)方法，必須要明確其最低的檢測(cè)濃度即靈敏度，以避免由于DNA濃度的影響而造成假陰性的結(jié)果。在本試驗(yàn)中，選取李痘病毒的D株系的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)，結(jié)果表明基因芯片檢測(cè)的靈敏度為5pg/μLDNA模板濃度。

基因芯片技術(shù)雖然目前已經(jīng)在許多方面得到了廣泛的應(yīng)用，但是在李痘病毒6個(gè)主要不同株系檢測(cè)鑒定方面還未見諸報(bào)道，因此本項(xiàng)目的研究對(duì)植物病毒的檢測(cè)特別是對(duì)李痘病毒的檢測(cè)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義并為其他植物病毒的檢測(cè)提供了一定的參考價(jià)值。

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作者簡(jiǎn)介：陳定虎（1985，5-），男，漢族，籍貫：湖北荊州，博士研究生，高工，研究方向：植物病毒檢疫。