劉海霞，聶新民，楊 軍

（1.永州市中心醫(yī)院檢驗科，湖南永州 425000；2.中南大學湘雅三醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410013；3.中南大學湘雅三醫(yī)院病理科，湖南長沙 410013）

·論 著·

MMP-9蛋白及mRNA在乳腺癌組織中的表達*

劉海霞1，聶新民2，楊 軍3

（1.永州市中心醫(yī)院檢驗科，湖南永州 425000；2.中南大學湘雅三醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410013；3.中南大學湘雅三醫(yī)院病理科，湖南長沙 410013）

目的研究基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白及m RNA在乳腺癌中的表達，探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中的臨床意義。方法用免疫組化法檢測MMP-9蛋白在乳腺癌、乳腺良性病變組織中的表達，用半定量反轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）的方法檢測組織中mRNA的表達。結果MMP-9蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率為69.6%（39/56），在乳腺良性病變組織中為20%（6/30），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MMP-9 mRNA在乳腺癌和乳腺良性病變組織中表達水平（灰度比值）分別為0.914 2±0.108 1、0.379 4±0.042 8，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論MMP-9蛋白及mRNA在乳腺癌組織中的表達與淋巴結轉移呈正相關，有可能作為判斷乳腺癌浸潤轉移能力的參考指標之一。

乳腺癌； 基質金屬蛋白酶-9； 免疫組織化學； 逆轉錄聚合酶鏈反應

乳腺癌是我國女性目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率每年都在增加［1］。乳腺癌患者死亡的原因主要在于癌細胞發(fā)生了轉移的同時還侵襲了身體的其他器官［2-3］。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）屬于基質金屬蛋白酶家族的明膠酶類，能夠降解細胞外基質（ECM），在腫瘤細胞生長、分化、侵襲、轉移、調節(jié)腫瘤血管生成及免疫監(jiān)視中起到重要作用，因此與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關，本研究采用不同方法檢測MMP-9在乳腺癌中的表達，旨在探討MMP-9表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2010年1月至2012年12月湘雅三醫(yī)院乳腺癌手術切除的組織標本56例，患者術前未接受過放療和化療。經(jīng)兩名病理醫(yī)師審閱均為原發(fā)性乳腺浸潤性導管癌，其中有淋巴結轉移者34例（60.7%），無淋巴結轉移者22例（30.3%）。同時隨機選取同期在湘雅三醫(yī)院病理確診為乳腺纖維腺瘤的患者30例，收集乳腺纖維瘤組織標本30例。標本投入液氮中速凍，然后置于-70℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測乳腺癌中MMP-9蛋白的表達 MMP-9單克隆抗體及SP試劑均購于福州邁新公司，MMP-9單克隆抗體工作液稀釋度為1∶100，AEC顯色，蘇木素復染。用PBS緩沖液代替一抗作為空白對照。腫瘤細胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒即為陽性細胞。

1.2.2 半定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測乳腺癌組織MMP-9 m RNA的表達 按Trizol（Invitrogen公司）試劑盒說明提取組織中總RNA后，并參照MBI公司逆轉錄試劑盒具體操作步驟，按說明合成cDNA。合成的cDNA經(jīng)PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳并分析電泳圖。

1.3 統(tǒng)計學處理對所獲得的數(shù)據(jù)應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，各表達指標的組間差異在進行方差齊性檢驗后，采用t檢驗或近似t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織及乳腺良性病變組織中MMP-9蛋白的表達免疫組化方法檢測MMP-9蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率為69.6%（39/56），陽性染色定位于腫瘤細胞胞漿見圖1、2。MMP-9與淋巴結轉移有關，有淋巴結轉移者，MMP-9表達較高，無淋巴結轉者，MMP-9表達較低，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 乳腺癌組織及乳腺良性病變組織中MMP-9 m RNA的表達 乳腺癌組織中MMP-9 mRNA的表達見圖3，所有組織標本均有MMP-9 mRNA的表達，其相對表達量（灰度比值）為

0.914 2±0.108 1；而乳腺良性病變組織MMP-9 m RNA相對表達量為0.379 4±0.042 8。乳腺癌組織明顯高于乳腺良性病變組織（P＜0.05）。

2.3 MMP-9 m RNA在乳腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系 MMP-9在腫瘤組織中的表達與腫瘤分期和淋巴結轉移呈正相關（P＜0.05）。分析發(fā)現(xiàn)，MMP-9蛋白表達高的病例，MMP-9 mRNA表達也較高。

3 討 論

基質金屬蛋白酶類（MMPs）是與腫瘤侵襲有關的最重要蛋白酶，主要是使ECM降解，使ECM維持平衡；且在重構組織，腫瘤形成和調控炎癥等各種生理與病理中起到重要的作用［4-5］。其產(chǎn)生來源一般是纖維母細胞、巨噬細胞和腫瘤細胞。MMPs通過降解ECM為腫瘤細胞提供轉移的通道［6］；還可加快血管生長速度，使腫瘤細胞的基膜與ECM得到降解。MMPs的存在能促進腫瘤發(fā)展、侵襲、轉移，尤其是對惡性腫瘤起到重要的作用。MMP-9是MMPs家族中最重要的酶類，MMP-9的表達能在乳腺上皮組織中檢測出來［7］，并且能將ECM與基膜降解，進而使癌細胞能進入其他組織，使其運動能力增強［8］。本研究顯示，MMP-9蛋白在乳腺癌組織中陽性表達率高于乳腺良性病變組織（P＜0.05）；無淋巴結轉移組MMP-9蛋白陽性表達率明顯低于淋巴結轉移組（P＜0.05），說明MMP-9的表達與淋巴結轉移相關，與國內學者鐘華等［9］在胃癌中的研究結果一致。

本實驗還采用半定量RT-PCR法檢測MMP-9 m RNA的水平，結果發(fā)現(xiàn)MMP-9 m RNA的平均表達水平與淋巴結轉移顯著相關，有淋巴結轉移組高于無轉移組（P＜0.05）；而國內學者王福玲等［10］研究表明MMP-9 mRNA在卵巢癌組織中均有較高表達，在正常卵巢組織中均低表達，且與淋巴結轉移相關，本實驗與該報道的結果具有一致性。

綜上所述，MMP-9在乳腺癌中的表達量可將乳腺癌中淋巴結發(fā)生轉移的情況反映出來；還能用于乳腺癌發(fā)生、侵襲和轉移情況的監(jiān)測；在治療乳腺癌時，以MMP-9作為靶點，可使乳腺癌細胞的侵襲與轉移能力降低。另外，有研究發(fā)現(xiàn)利用某些化學制劑或分子生物學技術能增強基質金屬蛋白酶組織抑制因子-l（TIMP-1）的活性或降低MMP-9的活性，可在一定程度上抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移［11-12］，這為今后進一步研究提供了指導方向。

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Expression of MMP-9 protein and its mRNA in the tissues of breast cancer*

Liu Haixia1，Nie Xinmin2，Yang Jun3

（1.Department of Clinical Laboratory，Central Hospital of Yongzhou City，Yongzhou，Hunan 425000，China；2.Department of Clinical Laboratory，the Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan 410013，China；3.Department of Pathology，the Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan 410013，China）

ObjectiveTo study expression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）protein and its mRNA in breast cancer and evaluate its significance in the occurrence，development and metastasis of breast cancer.MethodsThe protein expression of MMP-9 breast cancer were detected by using immunohistochemistry and the expression of mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）ResultsThe positive rate of MMP-9 protein expression in 56 cases of breast cancer was 69.6%（39/56），while in benign breast diseases was 20%（6/30），which were significantly different（P＜0.05）.The levels of MMP-9 mRNA were significantly higher in the patients with breast cancer than those in benign breast diseases（P＜0.05），which were 0.914 2±0.108 1 and 0.379 4±0.0428 respectively.ConclusionThe MMP-9 protein and mRNA expression in human breast cancers are positively correlated with the stage and lymph node metastasis.Expression of MMP-9 could be used as an indicator for the ability of invasion and metastasis of breast cancer.

breast cancer； matrix metalloproteinase-9； immunohistochemistry； reverse transcription polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.001

A

1673-4130（2015）17-2457-02

2015-01-08）

國家自然科學基金資助項目（81072270）。 作者簡介：劉海霞，女，副主任技師，主要從事臨床檢驗的研究。