伍彬?qū)帲倘尚粒?，鄂順梅，李有?qiáng)，葉大檸，魯 洋，陳 茶

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510006）

大腸埃希菌sdi A基因缺失株的建立*

伍彬?qū)?，蔡壬?，曾建明，鄂順梅，李有強(qiáng)，葉大檸，魯 洋，陳 茶△

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東廣州 510006）

目的為研究HSL信號(hào)分子對(duì)大腸埃希氏菌的影響而建立大腸埃希菌sdi A基因缺失株。方法通過(guò)Red重組系統(tǒng)敲除大腸桿菌BW25113和SM10λpir的sdiA基因，PCR測(cè)序鑒定；不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)A600值，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線；熒光定量PCR檢測(cè)csg D、csg B基因水平。結(jié)果PCR測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAman軟件比對(duì)分析，與預(yù)想結(jié)果一致；與野生株相比，sdiA基因突變對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯影響。結(jié)論成功建立BW25113、SM10λpir的sdi A基因缺失株，為后續(xù)研究銅綠假單胞菌信號(hào)分子HSL對(duì)大腸埃希菌的影響奠定了基礎(chǔ)。

大腸埃希菌； 基因敲除； Red重組系統(tǒng)； sdi A基因； HSL信號(hào)分子； 接合反應(yīng)

銅綠假單胞菌（PA）是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，近年來(lái)，PA耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重。目前認(rèn)為基因水平轉(zhuǎn)移是介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的重要途徑，其方式有：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合。接合介導(dǎo)的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移是PA多重耐藥的重要原因，但PA接合的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。有研究證明Ti質(zhì)粒在根癌土壤桿菌結(jié)合轉(zhuǎn)移過(guò)程中受到一種由細(xì)菌釋放，稱為接合因子的信號(hào)分子的調(diào)控。接合因子實(shí)質(zhì)上是一種酰基高絲氨酸內(nèi)酯（HSL）分子，能提高Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的頻率［1-2］。目前，有研究證實(shí)PA等革蘭陰性菌廣泛存在“群體感應(yīng)”系統(tǒng)。在“群體感應(yīng)”系統(tǒng)中，HSL分子作為自誘導(dǎo)劑來(lái)監(jiān)測(cè)群體密度［3］。當(dāng)細(xì)菌達(dá)到一定數(shù)量后，HSL濃度升高到一定閥值，啟動(dòng)一系列基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為，如：PA胞外酶的產(chǎn)生、發(fā)光菌的生物發(fā)光性、Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移、細(xì)菌抗生素的合成、毒性因子的表達(dá)、生物膜的形成等。課題組前期在國(guó)家自然科學(xué)基金資助下研究PA信號(hào)分子HSL對(duì)大腸埃希菌（E.coli）-PA接合反應(yīng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSL有促進(jìn)接合反應(yīng)，并引起接合相關(guān)基因tra I、traG和trbC表達(dá)增高的作用。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子sdi A是供體菌E.coli中唯一的HSL受體蛋白，為明確sdi A在接合中的作用，本文通過(guò)基因同源重組技術(shù)突變供體菌E.coli SM10λpir的sdiA基因，為后續(xù)研究HSL信號(hào)分子對(duì)E.coli-PA接合體系的影響打下基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料 BW25113菌株和基因敲除所用質(zhì)粒［4］：p KD3、p KD46、pCP20由Barry L.Wanner教授惠贈(zèng)，見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) sdiA基因突變所用引物D-sdiA_F/R引物序列參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行設(shè)計(jì)，另外按NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中E.coli基因組序列（登錄編號(hào)：NC_000913.2）設(shè)計(jì)測(cè)序引物C-sdi A_F/ R，見(jiàn)表2。

1.2.2 基因敲除 本試驗(yàn)通過(guò)Red重組技術(shù)敲除E.coli SM10λpir的sdiA基因［4］。以p KD3質(zhì)粒為模板，引物D-sdi A _F/R擴(kuò)增重組同源DNA，純化后電轉(zhuǎn)化SM10λpir（p KD46）感受態(tài)，篩選氯霉素抗性克隆，42℃培養(yǎng)消除p KD46質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化pCP20質(zhì)粒，再次42℃培養(yǎng)消除氯霉素抗性及pCP20質(zhì)粒，獲得候選菌株用于后續(xù)試驗(yàn)鑒定。

1.2.3 測(cè)序鑒定 以引物C-sdiA_F/R擴(kuò)增候選菌株，PCR產(chǎn)物通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳成像，同時(shí)送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAman軟件比對(duì)分析。

1.2.4 熒光定量PCR（qPCR） 挑取單個(gè)SM10λpir野生株及sdiA突變株菌落至3 m L LB培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min搖菌過(guò)夜，按1∶100比例稀釋到新鮮LB培養(yǎng)基中，30℃、200 r/ min搖菌8 h，離心收集菌液提取RNA后通過(guò)SYBR Green染料法定量檢測(cè)csg D和csg B基因表達(dá)，rpoD為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表2。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線和細(xì)菌染色 從-80℃取E.coli SM10λpir sdi A基因突變株與野生株，接種血平板，挑取單克隆至3 m L LB液體培養(yǎng)基中37℃，200 r/min增菌12 h，取各菌液調(diào)0.5 MCF，再各取20μL至3 m L LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/ min，于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)，在721分光光度計(jì)測(cè)定菌液A600值，繪制生長(zhǎng)曲線。同時(shí)進(jìn)行常規(guī)制片，革蘭染色，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)并成像。

2 結(jié) 果

2.1 sdi A基因敲除的鑒定 因PCR鑒定引物在sdi A基因突變處上下游約200 bp處，突變后染色體上殘留一個(gè)FRT序列，所以PCR產(chǎn)物應(yīng)為622 bp，而野生株則為1 169 bp。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。測(cè)序峰形圖顯示測(cè)序質(zhì)量良好，結(jié)果比對(duì)正確，見(jiàn)圖2（見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）。

2.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線顯示，E.coli SM10λpir sdi A基因突變株與野生株無(wú)明顯差異；此外，細(xì)菌培養(yǎng)4 h和12 h時(shí)的革蘭染色結(jié)果顯示SM10λpir sdi A基因突變株與野生株無(wú)明顯差異，提示sdiA突變對(duì)細(xì)菌表型無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖3、4（見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）。

2.3 qPCR檢測(cè)生物膜相關(guān)基因的變化［6］qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)E.coli SM10λpir sdiA基因突變株csg D和csg B基因表達(dá)量明顯高于野生株，提示csg D和csg B合成受sdi A蛋白影響，見(jiàn)圖5。

3 討 論

本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)受體菌PAO1的HSL合成基因缺失將降低E.coli-PA接合反應(yīng)頻率，因轉(zhuǎn)錄因子sdi A是供體菌E.coli中唯一的HSL受體蛋白，為明確sdi A在接合中的作用，本研究對(duì)供體菌E.coli SM10λpir sdi A基因進(jìn)行了靶向缺失突變。

Red同源重組是一種利用同源重組方法改變生物體某一內(nèi)源基因的遺傳學(xué)技術(shù)。它將靶基因突變位點(diǎn)左右各35～50 bp DNA片段連接到耐藥基因（本實(shí)驗(yàn)為氯霉素CmR）兩側(cè)，導(dǎo)入細(xì)菌后，在p KD46質(zhì)粒攜帶的λ噬菌體Red重組酶作用下，與染色體上靶基因發(fā)生同源重組，從而實(shí)現(xiàn)在基因水平上對(duì)目的基因的敲除、替換和突變等操作［4］。本研究以Red同源重組技術(shù)敲除sdi A基因，證實(shí)該技術(shù)是一種高效準(zhǔn)確的基因突變技術(shù)。

首先，本研究通過(guò)PCR測(cè)序檢測(cè)結(jié)果證實(shí)sdi A基因突變成功。其次，在細(xì)菌表型方面，sdi A基因高表達(dá)能夠抑制生物膜成分curli形成。因剛果紅能結(jié)合curli和纖維素，是檢測(cè)curli形成的非特異性試驗(yàn)［6］；所以課題組嘗試進(jìn)行剛果紅試驗(yàn)驗(yàn)證。然而結(jié)果發(fā)現(xiàn)SM10λpir和BW25113 sdi A基因突變株的剛果紅試驗(yàn)結(jié)果與野生株間無(wú)明顯差別（未在本文結(jié)果中描述），不能用于sdiA突變株表型鑒別。因此，本研究在基因水平上檢測(cè)了curli形成相關(guān)基因csg D和csg B的表達(dá)。結(jié)果提示csg D、csg B基因在SM10λpir sdiA缺失株高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，側(cè)面說(shuō)明試驗(yàn)菌株建立成功。

文獻(xiàn)報(bào)道，E.coli細(xì)胞分裂需要ftsQ、fts A和ftsZ產(chǎn)物的參與，而轉(zhuǎn)錄因子sdiA能識(shí)別ftsQAZ基因簇啟動(dòng)子［7］，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致細(xì)菌分裂加速，形態(tài)上多為短桿狀［8-9］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和對(duì)延緩期、對(duì)數(shù)期（4、12 h）的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，發(fā)現(xiàn)37℃下sdiA基因的缺失對(duì)E.coli SM10λpir菌株的生長(zhǎng)曲線和形態(tài)無(wú)明顯影響，與文獻(xiàn)報(bào)道的在sdi A基因高表達(dá)的條件下，sdi A蛋白促進(jìn)細(xì)菌分裂現(xiàn)象并不矛盾。

綜上所述，本文成功建立E.coli sdi A基因缺失株，為后續(xù)研究PA信號(hào)分子HSL對(duì)大腸埃希菌的影響奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of The sdiA Gene Mutant in Escherichia coli Strains*

Wu Binning，Cai Renxin#，Zeng Jianming，E Shunmei，Li Youqiang，Ye Daning，Lu Yang，Chen Cha△

（Department of Laboratory Medicine，the Second Clinical Medical College of Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006，China）

ObjectiveTo build sdiA gene muants of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir strains.MethodsThe sdiA gene of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were knocked out with Red recombination system.The mutants were detected by PCR technique，and the following sequencing results were analyzed through alignment by software DNAman.Growth curve of strains were assayed by detecting the A600 value at different time point.The csg D and csg B genes expression levels were detected by fluorescent quantitative PCR in SM10λpir sdi A mutant thereafter.ResultsPCR products electrophoresis showed a shorten fragment in mutants comparing to their parental strains BW25113 and SM10λpir，and it was confirmed by DNA sequencing.The growth curves and cells morphology in Gram stain were similar in both mutants and wild-type strains.The expression of csg D and csg B genes was higher in SM10λpir sdiA mutants than those in wild-type strain.ConclusionThe mutants of sdiA deletion of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were constructed successfully，and it will be the foundation for further research of the effects of the signal molecular HSL on Escherichia coli.

Escherichia coli； gene knockout； Red recombination system； sdi A gene； HSL signal molecular； conjugation reaction

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.005

A

1673-4130（2015）17-2466-03

2015-04-28）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81071397、81271909）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2013010012970）。 作者簡(jiǎn)介：伍彬?qū)?，男，碩士研究生在讀，主要從事臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)的研究；蔡王辛，男，檢驗(yàn)技師，主要從事臨床微生物與檢驗(yàn)的研究。#共同第一作者。

△通訊作者，Email：chencha906@163.com。