郭慶棟 李慎濤 張玉祥 賈弘褆△

（1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 北京，100069）

在生物體內(nèi)，糖基轉(zhuǎn)移酶催化活化的糖連接到不同的受體分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的產(chǎn)物具有很多生物學(xué)功能［1］。T4噬菌體β葡糖基轉(zhuǎn)移酶能特異性地將尿嘧啶二磷酸葡萄糖（UDP－Glc）的葡萄糖單元轉(zhuǎn)移至雙鏈DNA的5－羥甲基胞嘧啶殘基上，形成β－葡萄糖基－5－羥甲基胞嘧啶［2］。T4噬菌體β葡萄糖轉(zhuǎn)移酶可通過(guò)克隆T4噬菌體β－GT基因的重組大腸桿菌獲得。T4噬菌體β葡糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)5－h(huán)mC殘基的定向修飾來(lái)區(qū)分5－mC和5－h(huán)mC。這種酶可以將所有5－h(huán)mC糖基化，產(chǎn)生5－ghmC。這個(gè)反應(yīng)是序列無(wú)關(guān)的，因此所有5－h(huán)mC都將糖基化，而C或5－mC則不受影響［3］。

1 材料與方法

1.1 主要材料 T4噬菌體購(gòu)于美國(guó)ATCC，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，pMD－18T載體、qPCR試劑 盒 購(gòu) 于 Transgene 公 司，pGEX－6P－1 質(zhì) 粒 和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均為首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系李慎濤老師提供；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；核酸純化試劑盒購(gòu)自MN公司；氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶（BamH I、Xho I）購(gòu)自 NEB公司，T4DNA聚合酶、連接酶、Ex Taq酶均購(gòu)自 TAKARA 公司；Glutathione Sepharose－4B層析柱購(gòu)自GE公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體β－GT基因的PCR擴(kuò)增 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得噬菌體β－GT蛋白的基因序列，該序列的長(zhǎng)度為1056bp，編碼392個(gè)氨基酸，并組裝修飾形成β－GT蛋白。根據(jù)β－GT蛋白基因的編碼序列，設(shè)計(jì)了上下游引物，由北京生工公司合成：上游引物： 5’－ATCGGGATCCAAAATTGCTATAATTAATATG－3’；下游引物：5’－AAGGCTCGAGTTATAAATCAATAGCTTTTTTGAACGCATC－3’；在上下游引物的5’端分別引入BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，利用飽和酚、氯仿、異戊醇進(jìn)行噬菌體基因組DNA的提取和純化，用適量TE緩沖液將其溶解待用。以T4噬菌體基因組DNA為模板，用Ex Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增（20μL反應(yīng)體系）。擴(kuò)增條件為：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析鑒定并用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 取適量的PCR產(chǎn)物和pMD－18T載體混合，加5μL T4－DNA 連接酶，16℃連接過(guò)夜。取適量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于含100μg／mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12～16h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素（100μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12h，用堿裂解法提取質(zhì)粒，并用BamHI和XhoI雙酶切鑒定。膠回收酶切的目的片段，克隆至原核表達(dá)載體pGEX－6P－1中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 pGEX－6P－1－β－GT，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于含100μg／mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12～16h，挑取單菌落接種于含100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h，抽提質(zhì)粒、酶切鑒定并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)和表達(dá)鑒定 經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建成功的重組工程菌，取上述轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)后陽(yáng)性克隆培養(yǎng)物100μL接種于5L含100μg／mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩至菌液OD600達(dá)到0.6～0.8，分別加入1mmol／L IPTG誘導(dǎo)后，收集菌液離心后用1／10體積PBS重懸，加5xloading buffer 100℃煮沸10min，冷卻后取20μL上樣，進(jìn)行10%SDS－PAGE電泳（100V20min，150 V 1h）?？捡R斯亮藍(lán)染色15min，脫色液脫色5～12h，觀察結(jié)果。

1.2.4 蛋白的純化 通過(guò)比較不同誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度后，確定最佳誘導(dǎo)條件，即1mmol／L IPTG，誘導(dǎo)4h。將重組工程菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日細(xì)菌活化后，按照1∶100比例稀釋后加入500mL LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行大量表達(dá)。收集菌體后，用PBS重懸菌體，加入溶菌酶（終濃度至1g／L）、DTT（終濃度至1mmol／L）、PMSF（終濃度至1mmo／L），冰上作用30min，然后在冰浴上超聲至菌體完全裂解，15 000r／min離心30min。收集上清加入Glutathione Sepharose－4B親和層析柱中，讓其緩慢通過(guò)3～4次，用PBS沖洗5～10個(gè)柱床體積，最后用10mmol／L還原型谷胱甘肽（溶于50mmol／L Tris－HCl pH 8.0中）洗脫，并依次收集。

1.2.5 活性鑒定 用此蛋白對(duì)于5－h(huán)mC含量豐富的基因組進(jìn)行糖基化處理，用NEB公司的T4－β－GT酶作為陽(yáng)性對(duì)照，未做處理的樣品作為陰性對(duì)照，37℃12～16h，然后再用Msp I酶進(jìn)行酶切，37℃作用16h，40℃蛋白酶K消化30min后，95℃熱失活10min。以此處理后的樣品作為模板，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行qPCR鑒定。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）形式表示，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，獨(dú)立重復(fù)3次。數(shù)據(jù)處理采用Graph Prism 5軟件處理，t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 β－GT片段的擴(kuò)增 提取噬菌體基因組DNA，以噬菌體基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在1 100bp左右有一條帶，與β－GT片段的1 056bp大小基本一致且沒(méi)有非特異性條帶，經(jīng)序列測(cè)定確認(rèn)，此條帶序列與目的序列完全吻合，見(jiàn)圖1。

2.2 TA克隆 將PCR產(chǎn)物與pMD－18T載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取菌落，抽提質(zhì)粒，用Xho I單酶切產(chǎn)物電泳，陽(yáng)性克隆條帶位于3 856bp處；用BamH I和 Xho I進(jìn)行雙酶切產(chǎn)物電泳后，陽(yáng)性克隆出現(xiàn)的兩條帶分別位于約2 800bp和1 056bp處，見(jiàn)圖2。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用質(zhì)粒提取試劑盒抽提原核表達(dá)質(zhì)粒，用Xho I單酶切產(chǎn)物電泳，陽(yáng)性克隆條帶位于6056bp處，用BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切產(chǎn)物電泳后，陽(yáng)性克隆出現(xiàn)的兩條帶分別位于約5 000bp和1 056bp處，見(jiàn)圖3。

2.4 GST－β－GT融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，加不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)6h，誘導(dǎo)前后所收菌液分別取樣用10%SDS－PAGE膠和考馬斯亮藍(lán)染色方法進(jìn)行鑒定，0.8mM、1.0mM 和1.2mM IPTG誘導(dǎo)目的蛋白均有高表達(dá)，1.0mM 和1.2mM IPTG誘導(dǎo)效果接近，但明顯比0.8mM IPTG誘導(dǎo)效果好，最后將IPTG誘導(dǎo)濃度定在1.0mM，見(jiàn)圖4。

2.5 GST－β－GT 融 合 蛋 白 的 表 達(dá) 和 純 化 用1.0mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體超聲破碎、離心后，收集上清；利用 Glutathione Sepharose－4B親和層析柱進(jìn)行純化，用10mM還原性谷胱甘肽洗脫，組分收集，用SDS－PAGE鑒定各組分。如圖5所示，在第4～7管中，目的蛋白純度較好達(dá)95%。合并含有純目的蛋白的組分，用蛋白濃縮管濃縮至適當(dāng)?shù)臐舛龋?0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 GST－β－GT融合蛋白的活性鑒定 用純化后的目的蛋白對(duì)5－h(huán)mC含量豐富的基因組進(jìn)行糖基化處理，用NEB公司購(gòu)買(mǎi)的T4－β－GT酶作為陽(yáng)性對(duì)照，未做處理的作為陰性對(duì)照，qPCR進(jìn)行鑒定，以NEB公司購(gòu)買(mǎi)的T4－β－GT酶的活性為100%作為陽(yáng)性對(duì)照，未做處理活性為1%作為陰性對(duì)照，測(cè)定GST－β－GT融合蛋白的活性為77.2%，與購(gòu)買(mǎi)的T4－β－GT酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），GST－β－GT融合蛋白有糖基化酶活性，見(jiàn)圖6。

3 討 論

1952年就有文獻(xiàn)［4］報(bào)道哺乳動(dòng)物DNA胞嘧啶堿基存在兩種修飾：5－甲基胞嘧啶（5mC）和5－羥甲基胞嘧啶（5hmC）。5hmC是繼5－甲基胞嘧啶5mC之后發(fā)現(xiàn)的第六種堿基，已在多種哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中檢出。與5mC相比，5hmC的含量更低，但5hmC也具有非常重要的生物學(xué)功能。5hmC參與了染色體重新編程、基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并在DNA去甲基化過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5］。5hmC可能與特定腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可能成為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物。因此準(zhǔn)確高效的5hmC檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要，而β－GT酶為5hmC檢測(cè)技術(shù)提供了重要的支撐［6］。β－GT酶是T4噬菌體產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，具有高度選擇性和高效性，可特異性地將尿苷二磷酸葡萄糖的糖基轉(zhuǎn)運(yùn)至5－h(huán)mC生成5－gmC，而不能將糖基轉(zhuǎn)運(yùn)至5－mC［7］。5－mC可以被Tet酶氧化，而5－gmC則不能被Tet酶催化。TABSeq方法是通過(guò)β－GT酶和Tet酶兩種酶的共同作用，再經(jīng)亞硫酸鹽測(cè)序?qū)?－h(huán)mC和5－mC區(qū)分開(kāi)來(lái)［8］。甲基化依賴的限制性內(nèi)切酶 MspI和HpaII可識(shí)別同樣的序列（CCGG），但它們對(duì)甲基化狀態(tài)的敏感性不同：MspI識(shí)別并切割5mC和5hmC，但不能切割5－ghmC；HpaII只切割完全未修飾的位點(diǎn)，胞嘧啶上的任何修飾（5mC，5hmC，5－ghmC）均阻礙切割［9］。若CpG位點(diǎn)含有5hmC，那么糖基化、酶解之后能檢測(cè)到條帶，未糖基化對(duì)照反應(yīng)中沒(méi)有條帶；同時(shí)可采用qPCR進(jìn)行定量分析［10］。

本研究成功構(gòu)建了 pEGX－6P－1－GST－β－GT 融合蛋白的表達(dá)載體，能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)目的蛋白，經(jīng)GST親和層析柱純化可得到純的GST－β－GT融合蛋白。通過(guò)與NEB公司購(gòu)買(mǎi)的T4－β－GT酶進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了此GST－β－GT融合蛋白具有T4－β－GT酶的糖基化活性，可以將尿苷二磷酸葡萄糖的糖基轉(zhuǎn)運(yùn)至5－h(huán)mC生成5－gmC，可作為糖基化酶為表觀遺傳學(xué)5－h(huán)mC和5－mC的研究提供便利。在初步研究中所發(fā)現(xiàn)的5－h(huán)mC修飾在基因組DNA雙鏈上所存在的非對(duì)稱分布現(xiàn)象在基因表達(dá)調(diào)控等生物學(xué)作用方面的作用，以及在體內(nèi)生理?xiàng)l件下存在去羥甲基化的特異性酶促反應(yīng)過(guò)程等［11］。我們相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)人們會(huì)對(duì)5－h(huán)mC修飾的意義會(huì)有更為深刻的認(rèn)識(shí)，它有可能將會(huì)成為人們對(duì)于疾病表觀遺傳學(xué)研究的重要的里程碑。

（本文附圖見(jiàn)封三）

［1］ Miao Yu，Gary C Hon，Keith E Szulwach，et al.Base－Resolution Analysis of 5－Hydroxymethylcytosine in the Mammalian Genome［J］.Cell，2012 ，149（6）：1368－1380.

［2］ Junjie U Guo，Yijing Su，Chun Zhong，et al.Hydroxylation of 5－Methylcytosine by TET1Promotes Active DNA Demethylation in the Adult Brain［J］.Cell，2011，145（3）：423－434.

［3］ Sanchari Bhattacharyya，Yiting Yu，Masako Suzuki，et al.Genome－wide hydroxymethylation tested using the HELP－GT assay shows redistribution in cancer［J］.Nucleic Acids Res，2013，41（16）：157－167.

［4］ Wyatt GR，Cohen SS.A new pyrimidine base from bacteriophage nucleic acids［J］.Nature，1952，170（4338）：1072－1073.

［5］ Reik W，Dean W，Walter J.Epigenetic reprogramming in mammalian development［J］.Science，2001，293（5532）：1089－1093.

［6］ Ito S，D＇Alessio AC，Taranova OV，et al.Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion，ES－cell self－renewal and inner cell mass specification［J］.Nature，2010，466（7310）：1129－1133.

［7］ Moréra S，Grin I，Vigouroux A，et al.Biochemical and structural characterization of the glycosylase domain of MBD4bound to thymine and 5－h(huán)ydroxymethyuracil－containing DNA［J］.Nucleic Acids Res，2012，40（19）：9917－9926.

［8］ Boorstein RJ，Cummings A Jr，Marenstein DR，et al.Definitive identification of mammalian 5－h(huán)ydroxymethyluracil DNA N－glycosylase activity as SMUG1［J］.Biol Chem，2001，276（45）：41991－41997.

［9］ Jin SG，Kadam S，Pfeifer GP.Examination of the specificity of DNA methylation profiling techniques towards 5－methylcytosine and 5－h(huán)ydroxymethylcytosine［J］.Nucleic Acids Res，2010，38（11）：125－130.

［10］ Matsubara M，Masaoka A，Tanaka T，et al.Mammalian 5－formyluracil－DNA glycosylase［J］.Biochemistry，2003，42（17）：4993－5002.

［11］ Ficz G，Branco MR，Seisenberger S，et al.Dynamic regulation of 5－h(huán)ydroxymethylcytosine in mouse ES cells and during differentiation［J］.Nature，2011，473（7347）：398－402.