謝晉　史廷春　周陶　嚴(yán)明

摘要：目的 應(yīng)用組織工程和生物制造工程原理，采用增材制造技術(shù)，探索一種制造喉關(guān)節(jié)軟骨支架的新途徑。方法 利用明膠和海藻酸鈉作為材料，通過CCA-II細(xì)胞受控組裝機(jī)制備喉軟骨支架，然后對所制備支架進(jìn)行性能的表征。結(jié)果 制取出了粘度合適、降解率合適、高孔隙率和含水量的三維支架，類似喉軟骨外基質(zhì)成分。結(jié)論 增材制造技術(shù)與組織工程技術(shù)和生物制造技術(shù)的結(jié)合為未來修復(fù)喉功能提供一種潛在的手段。

關(guān)鍵詞：人工喉軟骨；增材制造；細(xì)胞受控組裝；生物3D打印

1喉軟骨支架制備方案

所謂組織工程就是運(yùn)用工程科學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，從根本上認(rèn)識正常和病理的組織結(jié)構(gòu)--功能關(guān)系，研究和開發(fā)一套具有生物相容性、組織相容性和生物活性的組織器官[1-3]，用以替代或修復(fù)已損傷的人體組織和器官，或進(jìn)一步改進(jìn)受損組織器官的生理功能。具體做法是：首先制備具有良好生物相容性和良好機(jī)械性能的生物材料支架，然后將種子細(xì)胞與生物材料支架混合培養(yǎng)，植入受損部位，待細(xì)胞生長、增殖、分化形成與原來組織器官具有相同形態(tài)，并且具有和原來組織器官相一致的生理功能的具有生物活性的組織器官替代物，同時生物材料支架也按照細(xì)胞生長、增殖、分化相匹配的速率降解，從而達(dá)到組織器官損傷修復(fù)和恢復(fù)其生理功能的目的[4-7]。

通過組織工程和生物3D打印技術(shù)原理，本文研究過程主要為以下內(nèi)容：喉軟骨支架的生物材料的選擇和喉軟骨支架的制取。其中主要為降解率合適、孔隙率高、含水率高且生物相容性好的喉軟骨支架。支架組裝過程如圖1所示，支架制取實驗在CCA-II細(xì)胞受控組裝機(jī)中完成。

2喉軟骨組織工程支架材料的選取

2.1喉的組成成分 成人的軟骨，根據(jù)軟骨組織內(nèi)所含纖維的成分不同，可分為三種類型，即透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨。而喉的軟骨屬于透明軟骨，是一種自身沒有血管，沒有神經(jīng)，沒有淋巴組織的特殊結(jié)構(gòu)。在透明軟骨中軟骨細(xì)胞僅占軟骨組織體積的1～5%。軟骨細(xì)胞的營養(yǎng)都是由軟骨基質(zhì)來提供的。軟骨細(xì)胞是一群比較特殊的細(xì)胞同時自身能夠合成和維持軟骨基質(zhì)的底層結(jié)構(gòu)[8]。因此，如何選取合適的支架材料對整個喉軟骨的作用至關(guān)重要。

2.2材料的選取 根據(jù)喉軟骨組織的組成成分以及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，理想的喉軟骨組織工程支架應(yīng)該具備以下特征：①良好的生物相容性，對細(xì)胞和機(jī)體無毒害；②良好的生物降解特性，可完全被機(jī)體降解吸收或排出體外；③良好的機(jī)械特性，具備一定的力學(xué)強(qiáng)度和可塑性，結(jié)構(gòu)長時間保持穩(wěn)定，具有較高的孔隙率；④良好的表面相容性，利于細(xì)胞在材料表面黏附與生長[9]。目前可作為喉軟骨組織工程支架的材料具體可分為三類，分別為天然高分子材料、人工合成高分子材料以及復(fù)合材料。天然高分子材料如膠原、殼聚糖等均取自天然動植物體，其都是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分或類似基質(zhì)構(gòu)成物，所以此類材料能夠很好的與生物體相容，有良好的仿生性和組織親和性，并能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且大多來源豐富，價格低，但也有質(zhì)地相對較軟，機(jī)械強(qiáng)度不足的缺點(diǎn)。而合成材料則是在天然材料的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，雖然在機(jī)械強(qiáng)度上能夠滿足需求，但其親水性差、細(xì)胞吸附力弱則是其與天然高分子材料相比不足之處。而復(fù)合材料的出現(xiàn)則改變了上述兩種材料的不完美，它即具備了天然材料組織相容性和親和性好的優(yōu)點(diǎn)，又提高了材料的機(jī)械強(qiáng)度，使得喉軟骨組織工程支架的材料變得更具可行性。

根據(jù)復(fù)合材料的這些優(yōu)點(diǎn)，本文采取制備明膠與海藻酸鈉復(fù)合材料的方法來喉軟骨組織工程支架，其中明膠是膠原的部分變性衍生物，在35℃以下時形成熱可逆性凝膠，具有高含水率及溫敏性[10]。海藻酸鹽可在Ca2+、Ba2+等二價陽離子的作用下發(fā)生溶膠凝膠相轉(zhuǎn)變，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和成形性。將二者相結(jié)合，得到含水率高、易于成形的明膠海藻酸鈉復(fù)合材料（GSA），在化學(xué)成分、柔軟性、對親水性營養(yǎng)和代謝物擴(kuò)散性等方面都與ECMs相似[10]，可用作基質(zhì)材料。其次，該材料模仿天然軟骨的蛋白多糖水凝膠基質(zhì)（含水85%～90%），可以作為喉軟骨的修復(fù)或替代材料。最后，該材料是由親水性聚合物經(jīng)水溶脹形成的，軟骨細(xì)胞可滲透入其中進(jìn)行生長。將該材料制成多孔狀，軟骨細(xì)胞還可由微孔進(jìn)入多孔水凝膠內(nèi)部生長[11，12]。

3支架的制取實驗

本實驗在CCA-II細(xì)胞受控組裝機(jī)中完成。首先把經(jīng)Mimics處理過的STL格式三維模型導(dǎo)入計算機(jī)中，再用Aurora軟件對該模型分層，得到CLI文件。將得到的CLI文件導(dǎo)入Cark軟件中，準(zhǔn)備Cark控制軟件來完成對組裝機(jī)進(jìn)行控制。設(shè)定系統(tǒng)組裝參數(shù)如表1所示，實驗前設(shè)定組裝機(jī)溫度在10℃，預(yù)冷30min。具體過程如下：①首先分別稱量濃度為20%的明膠溶液以及濃度為4%的海藻酸鈉溶液；②將稱量好的明膠與海藻酸鈉加入0.9%生理鹽水中制作成相應(yīng)濃度的共混液，并在65℃水浴鍋中加熱30min，邊加熱加用玻璃棒攪拌；③將海藻酸鈉溶液用CJJ78-1磁力加熱攪拌器在65℃恒溫下攪拌1～2h，至海藻酸鈉形成透明均勻膠狀體；④把制作好的海藻酸鈉溶液與明膠溶液按1：1混合，放入1000r/min離心機(jī)中離心10min，以去除溶液混合中產(chǎn)生的氣泡；⑤裝入細(xì)胞組裝機(jī)中打印。

支架制作完成后，滴加6%CaCl2交聯(lián)，大約交聯(lián)10min左右交聯(lián)完成，用PBS清洗兩次，得到成形支架，見圖2。

4 支架的性能表征

根據(jù)組織工程支架用于制取喉軟骨基質(zhì)的要求，支架需要滿足高含水量、有一定降解速率、高孔隙率以及膨脹率在一定范圍內(nèi)等要求，為此對支架的降解率、孔隙率、含水量以及膨脹率進(jìn)行表征。

支架的的降解率是組織工程支架重要的參數(shù)，本文利用測定支架的失重率來測量支架的降解率[13]，具體的過程是：首先將打印好的12個支架兩兩分成一組，取各組平均質(zhì)量，記為m1，加入PBS緩沖液中，保證支架完全浸泡在溶液中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中；每周定期更換PBS溶液，分別于第1，2，3，4，5，6w取一組樣品，用去離子水沖洗多次，稱重，取兩個樣品的平均質(zhì)量記為m2，按照下列公式來計算支架的降解率：

β = （m1-m2）/m1×100%

支架孔隙率采用排液法測定[14]，選擇所用的液體為乙醇，因其能夠很好地浸泡支架而不使支架溶解、膨脹或收縮。過程為：首先將支架真空干燥8h，稱重，記為m1；然后將干燥后的支架放入具有一定量乙醇的容器中，反復(fù)抽真空至支架不再有氣泡溢出，將浸泡在乙醇中的支架連同容器一起稱重，記為m2；最后將內(nèi)部還含有乙醇的支架從容器中取出，把不含支架的乙醇同容器稱重，記為m3。計算孔隙率的公式如下：

η =v1/（v2+v3）=（m2-m3-m1）/（m2-m3）×100%

其中，v1表示支架中孔隙所占有的體積；v2表示支架中材料的體積；v3表示樣品的總體積。

支架的含水量即支架內(nèi)水分的含量，具體測定過程為：首先將制備好的支架樣品浸泡在PBS緩沖液中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中24h，取出濾紙吸取表面多余水分，稱量支架質(zhì)量，記為m1；然后對支架進(jìn)行真空干燥8h，稱取干燥后支架質(zhì)量，記為m2，支架的含水量用以下公式計算[15]：

ɑ=（m2-m1）/m2×100%

最后，對支架的膨脹率進(jìn)行了測量，具體過程為：首先將支架放入PBS中，然后放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中24h；24h后稱取支架體積與質(zhì)量，分別為V1與m1；再將支架放入低溫冰箱中冷凍12h，凍干后得到固體凝膠支架，稱重，記為m2。利用公式計算支架膨脹率：

Vpbs =（m2-m1）/ρpbs

θ =Vpbs/V1×100%

5結(jié)果

由圖3所示，支架的降解率在2w內(nèi)降解率在14%左右，而且其降解率是呈直線上升，到第6w時支架重量下降到一半以上。根據(jù)組織工程支架對材料降解性的要求，需要支架能夠在2w內(nèi)保持其結(jié)構(gòu)及形狀的穩(wěn)定，以便支架能夠在體外進(jìn)行培養(yǎng)，本文所研究明膠-海藻酸鈉支架在2w內(nèi)只下降14%，能夠為軟骨細(xì)胞的黏附、生長及增殖提供充足的時間和空間，而且材料到第6w降解到其自身50%左右，其時間與軟骨細(xì)胞的增殖及分泌外基質(zhì)的速率相匹配，滿足組織工程支架對喉軟骨修復(fù)所要求的降解率。不僅如此，當(dāng)支架植入生物體內(nèi)時，由于體內(nèi)含大量對材料有酶性催化作用的物質(zhì)，會導(dǎo)致材料在體內(nèi)產(chǎn)生水解及氧化，而明膠在體內(nèi)水解后肽鍵斷裂，變成低分子多肽，低分子多肽仍能促進(jìn)細(xì)胞增殖及增加細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白[16]。因此，明膠-海藻酸鈉支架的降解率及降解產(chǎn)物的無毒性能滿足喉軟骨的體外增殖與分化。

支架的孔隙率及含水量是對于細(xì)胞在支架內(nèi)部傳輸營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的排出中起著重要作用，由表2看出，支架的孔隙率及含水量均達(dá)到80%以上，有利于促進(jìn)細(xì)胞代謝及加速營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，特別是支架模擬天然軟骨的蛋白多糖水凝膠基質(zhì)含水量在85～90%之間，為軟骨細(xì)胞提供類似細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，能夠為細(xì)胞的生長與增殖起到比較好的保護(hù)和促進(jìn)作用。表2中還對支架膨脹率進(jìn)行了測定，由于材料含水量比較高，因此，支架的膨脹率相對較大，但由于材料本身是含水的，本文測定的膨脹率是相對于干燥支架材料而言，實際的膨脹率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于這個數(shù)值，能夠滿足組織工程支架對維持支架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的要求。

6結(jié)論

本文從組織工程學(xué)出發(fā)，利用當(dāng)今比較流行的增材制造技術(shù)，結(jié)合實驗室現(xiàn)有的CCA-II細(xì)胞受控組裝機(jī)，試圖找到一個新的修復(fù)喉關(guān)節(jié)，尤其是喉軟骨缺損的方法，本文通過細(xì)胞受控組裝系統(tǒng)，對不同明膠濃度的實驗，研究出了比較適合制作支架的明膠與海藻酸鈉濃度，實現(xiàn)了細(xì)胞支架的打印，說明了明膠-海藻酸鈉支架有高孔隙率與含水量以及比較合適的生物降解性，是作為喉軟骨基質(zhì)的很好的材料，尤其作為多孔支架，有利于細(xì)胞粘附及生長。本文的研究為后面需要做相關(guān)支架植入動物體內(nèi)提供較好的參考，為整個喉支架的制作及動物實驗做了很好的鋪墊。雖然本文初步證實了明膠與海藻酸鈉混合材料作為喉軟骨支架的可行性，但與實際喉軟骨有一定的差距，因此，在不斷研究出新材料的基礎(chǔ)上，選擇怎樣的交聯(lián)方法以及制備工藝將會是今后的研究方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]屠規(guī)益.喉癌與下咽癌現(xiàn)代理論與臨床[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2002： 2.

[2]M.J. Russell， D.M. Rubin， B. Wigdorowitz， T.Marwala. The Artificial Larynx： A Review of Current Technology and a Proposal for Future Development[C].14th Nordic-Baltic Conference on Biomedical Engineering and Medical Physics，2008，20：160-163.

[3]付明亮，孫興和，劉漢強(qiáng)，等.全喉切除術(shù)后喉再造3例[J].四川醫(yī)學(xué)，2003，23（5）：512-513.

[4]MLNg，CL Kwok，SF Chow.Speech performance of adult cantonese-speaking laryngectomees using different types of alaryngeal phonation[J]. Journal of Voice，1997，11（3）：338-344.

[5]B M Op de Coul， F J Hilgers， A J Balm， et al. A decade of postlaryngectomy vocal rehabilitation in 318 patients： a single Institution's experience with consistent application of provox indwelling voice prostheses[J]. Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，2000， 126（11）： 1320-1328.

[6]何森，張其清.關(guān)節(jié)軟骨組織工程的研究進(jìn)展[J].國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2007，30（4）：247-251.

[7]Hellman KB. Bioartificial Organs as Outcomes of Tissue Engineering Scientific and Regulatory Issues[J]. Annals of the New York Academy of Sciences，1997，831（12）：1-9.

[8]Bhosale AM， Richardson JB. Articular cartilage： structure， injuries and review of management[J]. Br Med Bull，2008，87（8）：77-95.

[9]Kim BS， Mooney DJ. Development of biocompatible synthetic extra cellula rmatrices for tissue engineering[J]. Trends Biotechnol， 1998，16（5）： 224-232.

[10]Landers R， H bnerb U， Schmelzeisenb R， et al. Rapid prototyping of scaffolds derived from thermoreversible hydrogels and tailored for applications in tissue engineering[J]. Biomaterials， 2002， 23（12）：4437-4447.

[11]Panouille M， Larreta-garde V. Gelation behavior of gelatin and alginate mixtures[J]. Food Hydrocolloids， 2009， 23（4）： 1074-1080.

[12]程晉生.海藻酸鹽和明膠/海藻酸鈉混合凝膠[J].明膠科學(xué)與技術(shù)，2004，24（4）：169-177.

[13]郝和平.醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)實施指南[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000：187-197.

[14]鄭興華，高媛.等離子熔射成形件的孔隙率測定[J].機(jī)械工藝師，2001，32（2）：41-42.

[15]Freyman TM， Yannas IV， Cibson LJ. Cellular materials as porous scafforlds for tissue engineering[J].Prog Mat Sci，2001，46：273-282.

[16]許方，婧偉，李潮.明膠降解物對大鼠真皮成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原蛋白分泌的影響[J].中國微創(chuàng)外科雜志，2007，7（8）：815-817.編輯/申磊