伍丹丹，張吉翔，劉玉蘭，柳 舟，董衛(wèi)國

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢430060

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，除了手術(shù)，目前沒有其他有效的治療方法，且手術(shù)患者多于1 年內(nèi)死亡［1-2］，對人們健康構(gòu)成巨大威脅。病理上胰腺癌患者約90%屬于腺癌，90%為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌，早期臨床癥狀多不典型。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，雖有多種基因表達(dá)產(chǎn)物被證實與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其分子機(jī)制大多不明確［3-4］。研究［5］報道，去整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)9 基因是在胰腺癌中過表達(dá)的候選基因之一。ADAM9 又稱mehrin γ，是ADAM 大家族的一員，屬于1 型跨膜蛋白，含有8 個結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)ADAM9 在前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等多種惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移癌中表達(dá)顯著升高［6-8］，在小鼠腫瘤模型中有促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用［9］。ADAM9 可以裂解和釋放腫瘤發(fā)生和血管生成的重要分子，如EGF、Tie-2、FGFR2iiibFlk-1、EphB4、CD40、VCAM-1、TNF-α 和VE-cadherin，有助于細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，在高表達(dá)的腫瘤組織中可作為潛在的治療靶點［10］。本研究旨在探討ADAM9 在胰腺癌組織中的蛋白表達(dá)量，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，為胰腺癌的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 胰腺癌組織芯片(OD-CT-DgPan03)購自上海芯超生物科技有限公司，包含人胰腺導(dǎo)管腺癌31 例，每例均提供相應(yīng)癌旁組織(病檢均為正常胰腺組織);男20 例，女11 例，平均年齡(59.13 ±9.86)歲;根據(jù)WTO 腫瘤細(xì)胞病理分級［11］，Ⅰ級(高分化)4例，Ⅰ～Ⅱ級(介于高分化和中分化之間)4 例，Ⅱ級(中分化)23 例。所有組織均經(jīng)10%的甲醛緩沖液固定24 h，并經(jīng)過統(tǒng)一方法加工處理，采用美國Superfrost Plus 或APES 處理的Superfrost Plus 防脫載玻片固定組織標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑:鼠抗人ADAM9 單克隆抗體，購自美國R＆D 公司，工作濃度按1∶200 稀釋;即用型免疫組化超敏SP(鼠/兔)試劑盒、氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司;PBS 購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)公司。

1.2.2 免疫組化染色:采用免疫組化SP 法，按照試劑盒染色步驟，切片常規(guī)脫蠟，微波抗原修復(fù)，BSA 封閉，滴加一抗過夜，滴加生物素化的鼠抗兔IgG 30 min，DAB 染色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。采用PBS 代替一抗作空白對照，非免疫血清代替一抗作陰性對照，已知陽性片作陽性對照。

1.2.3 ADAM9 半定量積分法［12］:根據(jù)細(xì)胞對染色反應(yīng)的陽性強(qiáng)度及陽性細(xì)胞率分別進(jìn)行分級計分。每張切片至少選取5 個高倍(400 倍)視野，每個視野計數(shù)100 個細(xì)胞，細(xì)胞的染色強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記為0、1、2、3 分，染色強(qiáng)度≥1 分的細(xì)胞記為陽性細(xì)胞;ADAM9 陽性細(xì)胞率取5 次陽性細(xì)胞計數(shù)平均百分?jǐn)?shù)，按＜25%、25% ～50%、51% ～75%、＞75%分別記為0、1、2、3 分。根據(jù)上述兩項記分之和判斷結(jié)果，≥2 分的記為ADAM9 表達(dá)陽性，＜2分的記為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定性資料采用配對χ2檢驗及Fisher 確切概率法。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 ADAM9 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，但主要在胞漿中，呈彌散分布，染色呈淺黃色、棕黃色或棕褐色者為陽性細(xì)胞(見圖1)。

圖1 ADAM9 在胰腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(SP 400 ×) A:癌旁正常組織中呈陰性表達(dá);B-1、B-2:Ⅰ級胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌組織中表達(dá)升高;C-1、C-2:Ⅱ級胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯升高Fig 1 The expression of ADAM9 in pancreatic cancer tissues and paracancerous tissues (SP 400 ×) A:the expression of ADAM9 in paracancerous tissues was negative;B-1，B-2:the expression of ADAM9 in the Ⅱgrade pancreatic cancer tissues was increased;C-1，C-2:the expression of ADAM9 in the Ⅱgrade pancreatic cancer tissues was increased obviously

2.2 ADAM9 在胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中的表達(dá) ADAM9 主要表達(dá)在胰腺癌組織中，總得分為1 ～6 分，ADAM9 陽性表達(dá)率高達(dá)80.65%(25/31);癌旁正常組織中多數(shù)導(dǎo)管上皮呈陰性著色，部分胞漿呈弱著色，細(xì)胞膜均未有陽性著色，ADAM9 陽性表達(dá)率僅為9.68%(3/31)。經(jīng)配對χ2檢驗分析，ADAM9 在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)明顯高于癌旁正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1，P ＜0.01)。

2.3 胰腺癌組織中ADAM9 的陽性表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系 經(jīng)Fisher 確切概率法分析，在胰腺癌組織中ADAM9 的陽性表達(dá)與胰腺癌的WTO 細(xì)胞病理分級和年齡有關(guān)(P ＜0.05)，與患者性別無明顯相關(guān)性(P ＞0.05，見表1)。

3 討論

胰腺癌是全球惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的主要原因之一，臨床上診斷為胰腺癌的患者生存時間多不超過兩年，中位生存期僅為2 ～3 個月。胰腺癌在診斷時多已發(fā)展為進(jìn)展期腫瘤或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位有肝臟、肺臟和腹膜。治療目標(biāo)通常是緩解癥狀，治愈幾乎不可能，手術(shù)或化學(xué)療法多是為提高患者存活率或末期生活質(zhì)量。

表1 胰腺癌組織中ADAM9 的陽性表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系［例數(shù)(%)］Tab 1 Relationship between the expression of ADAM9 in pancreatic cancer tissue and clinical parameters［n(%)］

腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移必須具備兩個條件，即腫瘤血管生成和破壞細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，ECM 是腫瘤組織轉(zhuǎn)移的第一道屏障。Liotta等［13］提出了腫瘤細(xì)胞侵襲過程的3 步假說:腫瘤細(xì)胞之間解黏附及腫瘤細(xì)胞與ECM 黏附，腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞分泌蛋白水解酶使ECM 降解，腫瘤細(xì)胞被生長因子和趨化因子誘導(dǎo)，向縱深運(yùn)動，發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移。細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用對組織穩(wěn)態(tài)具有重要作用，異常的細(xì)胞作用能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移，其中涉及一些重要的細(xì)胞分子，如EGF、Tie-2、FGFR2iiibFlk-1、EphB4、CD40、VCAM-1、TNF-α 和VEcadherin 等，這些分子多為腫瘤發(fā)生和血管生成的重要分子，在被蛋白酶水解或細(xì)胞釋放后才能發(fā)揮作用，而ADAMs 是這些分子發(fā)生作用所涉及的主要酶類［10］。

ADAMs 是具有破壞細(xì)胞黏附、降解ECM 及促進(jìn)血管生成等多種生物學(xué)功能的1 型跨膜蛋白，含有一個N 端的金屬蛋白酶區(qū)域、去整合素區(qū)域、半胱氨酸富含區(qū)域、內(nèi)皮生長素樣區(qū)域及具有潛在信號模體的大胞質(zhì)尾。ADAM9 是該家族廣泛表達(dá)的蛋白之一，在正常組織中多為低表達(dá)，而在腎癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和結(jié)腸癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)。研究報道，ADAM9 在腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。ADAM9 在小鼠模型中有腫瘤發(fā)生的作用［9］;過表達(dá)的ADAM9 蛋白可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲力［6-10］，沉默ADAM9 基因則可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲力［14］;敲除ADAM9 基因后，可促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，增加對放化療的敏感性，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲力［15］。

本次研究通過免疫組化的方法檢測ADAM9 在胰腺癌中的表達(dá)量，并分析表達(dá)量的差異是否與腫瘤細(xì)胞的分化程度和患者年齡、性別相關(guān)。ADAM9 在胰腺癌中的陽性表達(dá)率高達(dá)(80.65%)，明顯高于癌旁正常胰腺組織(9.68%)，且主要表達(dá)于細(xì)胞的胞漿中。ADAM9 的表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞的分化程度有關(guān)，在高分化的胰腺癌中陽性表達(dá)率為較低，在中分化的胰腺癌中陽性表達(dá)率較高，因此，ADAM9 的表達(dá)可能與胰腺癌的惡性程度有關(guān)。ADAM9 的表達(dá)在不同年齡層中也有明顯差異，≥60 歲的胰腺癌病例比＜60 歲的胰腺癌病例陽性表達(dá)率高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。年齡是胰腺癌發(fā)生的一個重要高危因素，因此，ADAM9 可能是導(dǎo)致高危人群發(fā)生胰腺癌的原因之一。

ADAM9 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制有:(1)ADAM9 通過整合素區(qū)域作用于細(xì)胞黏附及細(xì)胞與基質(zhì)黏附。ADAM9 結(jié)合α6β1整合素后可顯著誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活力來促進(jìn)細(xì)胞遷移［16］，在非小細(xì)胞肺癌中ADAM9 作為配體結(jié)合α3β1整合素，能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力，引起腦組織發(fā)生轉(zhuǎn)移［17］。(2)ADAM9 可作為蛋白水解酶降解ECM，ADAM9 金屬蛋白酶區(qū)域在弗林蛋白轉(zhuǎn)換酶的作用下使無活性的蛋白水解酶前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍姿饷?，可以降解ECM蛋白，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供有力的條件。(3)去整合素區(qū)域和半胱氨酸富含區(qū)域有助于腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生黏附，促進(jìn)ADAM9 金屬蛋白酶在腫瘤細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮作用［18］。另外，ADAM9 可通過裂解EGF 受體配位子和成纖維細(xì)胞因子受體而促成前列腺癌的發(fā)生［9］，ADAM9 也可裂解和釋放腫瘤發(fā)生和血管生成的其他重要分子，如EFGFR2iiib、Tie-2、Flk-1、EphB4 等。ADAM9 可在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程的每一步發(fā)揮作用，因此，ADAM9 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究表明，ADAM9 在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胰腺組織，且ADAM9 的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度和患者年齡具有相關(guān)性，提示ADAM9 促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。由于病例數(shù)較少及臨床資料不完整，未能分析ADAM9 表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存時間等是否相關(guān)。

綜上所述，ADAM9 的表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為提示腫瘤惡性生物學(xué)行為的一個指標(biāo)，且可為臨床治療胰腺癌提供新的靶點。

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