鄧結(jié)平, 李 赟, 潘魯青

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)

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四溴雙酚A對7種海洋微藻的急性毒性?

鄧結(jié)平, 李 赟??, 潘魯青

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003)

本文研究了四溴雙酚A(TBBPA)對7種海洋微藻(微擬球藻、塔胞藻、亞心形扁藻、牟氏角毛藻、三角褐指藻、湛江等鞭金藻、等鞭金藻塔溪堤品系)的急性毒性。分析了不同質(zhì)量濃度TBBPA暴露下7種微藻的相對生長率、抑制率，結(jié)果顯示，7種海洋微藻對TBBPA的敏感性不同，存在明顯的時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)。采用概率單位—濃度對數(shù)法得到TBBPA對牟氏角毛藻、微擬球藻、等鞭金藻塔溪堤品系、湛江等鞭金藻、塔胞藻的96h半效應(yīng)濃度分別為2.59、2.64、4.23、4.35和6.71mg·L-1，均屬于高毒性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)牟氏角毛藻在2.44mg·L-1的TBBPA作用下96h抑制率為54.72%，微擬球藻在3.456mg·L-1的TBBPA作用下96h抑制率為70.27%，等鞭金藻塔溪堤品系在6mg·L-1的TBBPA作用下96h抑制率為76.64%，湛江等鞭金藻在2.83mg·L-1的TBBPA作用下96h抑制率為39.24%，塔胞藻在9.83mg·L-1的TBBPA作用下96h抑制率為54.21%，三角褐指藻在濃度為9.83mg·L-1的TBBPA作用下96h抑制率為22.84%，亞心形扁藻在濃度14.6mg·L-1的TBBPA作用下96h抑制率僅為14.11%。結(jié)果顯示，微擬球藻和牟氏角毛藻對TBBPA最敏感，可以作為潛在的生物指示物。

四溴雙酚A；海洋微藻；急性毒性；96h半效應(yīng)濃度

四溴雙酚A(Ietrabromobisphenol A，TBBPA)是目前世界上使用最廣泛、全球產(chǎn)量最大的溴系阻燃劑之一[1]，在四溴雙酚A生產(chǎn)、應(yīng)用過程中，未結(jié)合的TBBPA常會(huì)釋放到環(huán)境中并聚集在生態(tài)系統(tǒng)中[2-3]。目前，TBBPA在空氣、土壤、底泥、水生生物體內(nèi)，甚至在人體血液及母乳中均已被檢測到[3-5]。有關(guān)研究表明，TBBPA具有神經(jīng)毒性[6]、免疫毒性[7]、腎毒性[8]和肝毒性[9-10]。由于它的化學(xué)結(jié)構(gòu)與甲狀腺激素結(jié)構(gòu)相似，可能是一種潛在的內(nèi)分泌干擾物。

微藻是水域生態(tài)系統(tǒng)中的主要初級生產(chǎn)者，其種類的多樣性及初級生產(chǎn)量直接影響水生生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能以及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和平衡。目前，有關(guān)TBBPA對海洋微藻毒性影響的研究僅涉及小球藻[14]、四尾柵藻[12-13]和中肋骨條藻[11]等少數(shù)幾種,關(guān)于其對微藻的毒性效應(yīng)和對生態(tài)系統(tǒng)的影響的報(bào)道還較少。本文研究TBBPA對7種海洋微藻的急性毒性并求得其96h EC50，以期反映不同種類微藻對TBBPA的耐受性，為篩選微藻作為TBBPA生物指示物和開展TBBPA的生態(tài)安全評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微藻及其培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用藻種分別為微擬球藻(Nannochloropsisoculata)、塔胞藻(Pyramimonassp.)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)和等鞭金藻塔溪堤品系(TahitianIsochrysisgalbana)，這7種微藻均來自中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫。

將生長至指數(shù)生長期的微藻用于實(shí)驗(yàn)。7種微藻均采用常規(guī)f/2培養(yǎng)基[15]培養(yǎng)(硅藻培養(yǎng)時(shí)需加入硅酸鹽)，實(shí)驗(yàn)海水為青島近海自然海水。250mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)體積為100mL，置于光照培養(yǎng)箱，溫度為(24±2)℃，光照強(qiáng)度為50μmol/(m2·s)，明暗周期為12h∶12h。實(shí)驗(yàn)期間保持所有實(shí)驗(yàn)瓶受光均勻，并每天定時(shí)搖瓶3次。

1.2 TBBPA濃度設(shè)置

實(shí)驗(yàn)所用TBBPA購于Sigma公司，純品為白色粉末。首先將TBBPA溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)配成TBBPA母液，隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配制成不同濃度的工作液。在微藻培養(yǎng)液中加入一定體積的工作液用于實(shí)驗(yàn)，基于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》(HJ/T 154-2004)，并根據(jù)程樹培[16]的等對數(shù)間距法分別設(shè)置7種海洋微藻的5個(gè)梯度的TBBPA實(shí)驗(yàn)濃度(見表1)，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的DMSO濃度均小于0.01%，每組設(shè)3個(gè)平行。同時(shí)設(shè)置一組只含有DMSO無TBBPA的助溶劑對照組和一組既無DMSO也無TBBPA的空白對照組。

表1 TBBPA濃度設(shè)置Table 1 Concentration set of TBBPA

1.3 藻細(xì)胞計(jì)數(shù)及TBBPA毒性分析

在培養(yǎng)基中接種微藻后，在0、24、48、72和96h取樣，在光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞的數(shù)目。根據(jù)各處理組不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞密度，按照國際經(jīng)合組織(OECD)規(guī)定的藻類生長阻抑制標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算藻類細(xì)胞生長速率μ,

μt=(lnNn-lnN1)/(tn-t1)，

式中:μt為t時(shí)間(d)的生長速率;N1為t1時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞起始數(shù)量);Nn為tn時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)。

TBBPA對微藻的毒性通過計(jì)算生長抑制率I(%)和96h的EC50來反映。生長抑制率I(%)計(jì)算參照美國材料與實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Society for Testing and Materials)[17]推薦的方法。計(jì)算公式為:

I=(μc-μt)/μc×100%，

式中:μc為對照組的生長速率；μt為處理組t時(shí)間的比生長速率。96h EC50計(jì)算采用概率單位-濃度對數(shù)法，通過直線回歸得到濃度效應(yīng)方程；當(dāng)概率單位為5時(shí)，計(jì)算96hEC50。

1.4 數(shù)據(jù)處理

處理組與對照組間各指標(biāo)的差異顯著性采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TBBPA對7種微藻相對生長率的影響

在實(shí)驗(yàn)的96h內(nèi)，7種海洋微藻的DMSO對照組與空白對照組之間均無顯著差異(P>0.05)，表明DMSO濃度小于0.01%對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。相比于DMSO對照組，隨著處理時(shí)間的延長，不同濃度TBBPA處理組海洋微藻表現(xiàn)不同的生長抑制效應(yīng)，如高濃度處理組，海洋微藻在48h后均受到明顯抑制，并隨處理時(shí)間的延長和處理濃度的加大抑制作用逐漸增強(qiáng)(見圖1)。如微擬球藻，藻細(xì)胞數(shù)在處理24h時(shí)所有濃度組與對照組均無顯著差異(P>0.05)；在48h時(shí)，低濃度組(1.67和2.00mg·L-1)與DMSO對照組之間仍無顯著差異(P>0.05)，而高濃度組(2.40、2.88和3.46mg·L-1)與DMSO對照組均存在極顯著性差異(P<0.01)；到了72h后，所有TBBPA處理組與DMSO對照組均存在極顯著性差異(P<0.01)，結(jié)果表現(xiàn)出TBBPA對微藻生長存在明顯的時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)。

在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在高濃度TBBPA處理下，微擬球藻、塔胞藻、等鞭金藻塔溪堤品系的細(xì)胞增殖被明顯抑制，此時(shí)可以在三角瓶瓶底觀察到白色沉淀。鏡檢顯示高濃度處理組塔胞藻細(xì)胞膨脹、顏色暗淡，視野中存在大量的細(xì)胞破碎物，這可能是高濃度的TBBPA造成細(xì)胞過氧化程度嚴(yán)重，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜溶解。

對7種海洋微藻的相對生長率的分析可知(見表2)，在低濃度TBBPA處理下，7種微藻96h相對生長率下降均不明顯，如牟氏角毛藻在1.0mg·L-1的TBBPA作用下，其相對生長率甚至略高于DMSO對照組，但無顯著差異(P>0.05)。而高濃度TBBPA處理，7種海洋微藻相對生長率均比各自的DMSO對照組有不同程度的下降，如塔胞藻、等鞭金藻塔溪堤品系、微擬球藻和牟氏角毛藻處理組依次為相應(yīng)對照的0.75、0.65、0.53和0.47，下降幅度較大。湛江等鞭金藻僅下降了0.29，三角褐指藻和亞心形扁藻僅下降0.17和0.07，但本實(shí)驗(yàn)用于處理三角褐指藻和亞心形扁藻的TBBPA處理濃度并不低，這說明TBBPA對不同種微藻生長的影響存在顯著不同。

(A、B、C、D、E、F、G分別為TBBPA對微擬球藻、塔胞藻、亞心形扁藻、牟氏角毛藻、三角褐指藻、湛江等鞭金藻、等鞭金藻塔溪堤品系生長的影響。A、B、C、D、E、F、G representN.oculata、Pyramimonassp.、P.subcordiformis、C.muelleri、P.tricornutum、I.zhanjiangensisandTahitianI.galbana,respectively.)

圖1 TBBPA對7種海洋微藻生長的影響Fig.1 The effect of different concentrations of TBBPA on the growth of seven marine microalgae

注：括號內(nèi)數(shù)字代表TBBPA濃度(mg·L-1)。

Note: stand for TBBPA concentration (mg·L-1).

2.2 不同濃度TBBPA對7種微藻抑制率的影響

進(jìn)一步比較不同濃度TBBPA對7種微藻96h的抑制率，結(jié)果見表3。在低濃度TBBPA處理下，TBBPA對微擬球藻的抑制率為14.01%，對湛江等鞭金藻為10.23%，對三角褐指藻為5.08%，對亞心形扁藻為4.52%，對塔胞藻為3.69%，對等鞭金藻塔溪堤品系為0.75%，低濃度TBBPA對牟氏角毛藻有一定的刺激作用，抑制率為-1.67%。但隨著處理濃度的增加，TBBPA對7種海洋微藻的抑制率逐漸增加，對塔胞藻的抑制率最高，為114.00%，表明這一處理濃度已造成部分藻細(xì)胞的死亡。對塔溪堤等鞭金藻為76.64%，對微綠球藻為70.27%，對牟氏角毛藻為54.72%，對湛江等鞭金藻為39.24%，對三角褐指藻和亞心形扁藻的抑制率仍不高，僅為22.84%和14.11%。

2.3 TBBPA對海洋微藻的96h EC50

基于7種微藻在不同濃度TBBPA處理的生長情況，計(jì)算各自的96h EC50，結(jié)果顯示(見表4)。在相同的光照強(qiáng)度、溫度、pH等條件下，TBBPA對牟氏角毛藻、微擬球藻、等鞭金藻塔溪堤品系、湛江等鞭金藻、塔胞藻的96h EC50分別為2.59、2.64、4.23、4.35和6.71mg·L-1。三角褐指藻因在TBBPA處理的最高濃度9.83mg·L-1作用下96h時(shí)抑制率僅為22.84%，亞心形扁藻在TBBPA處理的最高濃度14.6mg/L作用下96h的抑制率僅為14.11%，未計(jì)算出其96h EC50。但顯然這2種微藻的96h EC50要遠(yuǎn)高于以上5種海洋微藻。

表3 7種海洋微藻抑制率Table 3 Inhibition rate of seven marine microalgae

注：括號內(nèi)數(shù)字代表TBBPA濃度(mg·L-1)。

Note: stand for TBBPA concentration (mg·L-1).

表4 TBBPA對5種海洋微藻的96h EC50Table 4 96h EC50 values of TBBPA for five kinds of marine microalgae

注：x為TBBPA濃度的對數(shù)；y為抑制率的概率單位。

Note:xstand for Logarithin of TBBPA concentration;ystand for Probability unite of inhibition rate.

基于《新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則(HJ/T154-2004)》[18]中的評判標(biāo)準(zhǔn)(極高毒性：≤1mg/L，高毒性：1～10mg/L，中毒性：10～100mg/L，低毒性：≥100mg/L)，TBBPA對微擬球藻、塔胞藻、牟氏角毛藻、湛江等鞭金藻、等鞭金藻塔溪堤品系均為高毒性，而對三角褐指藻和亞心形扁藻的毒性可能為中毒性。

3 討論

據(jù)報(bào)道TBBPA對哺乳動(dòng)物的毒性較低[19-20]，但對藻類、軟體動(dòng)物、甲殼類和魚類有很高的急性毒性[21-23]。盡管目前有關(guān)TBBPA對生物毒性方面的研究涉及到不少生物種類，但在微藻上的研究僅有四尾柵藻、小球藻和中肋骨條藻等少數(shù)幾種。Walsh等[12]研究表明，TBBPA對四尾柵藻的96h EC50為1.5mg·L-1，也有研究[13]顯示TBBPA對四尾柵藻的96h EC50為1.202mg·L-1。那廣水等[14]研究表明，TBBPA對小球藻的96h EC50為0.0455mg·L-1。TBBPA對海洋微藻中肋骨條藻的96h EC50為0.09～0.89mg·L-1[11]。本文同時(shí)研究了TBBPA對7種海洋微藻的急性毒性，結(jié)果表明，高濃度TBBPA處理對7種微藻的生長均有一定的抑制作用，且存在明顯的時(shí)間—?jiǎng)┝啃?yīng)關(guān)系。7種海洋微藻中，牟氏角毛藻的96h EC50最小，為2.59mg·L-1，96h EC50最高的可能為亞心形扁藻，其在濃度高達(dá)14.6mg·L-1的TBBPA處理96h下,抑制率僅為14.11%。

QSAR方法研究表明，有機(jī)化合物對水生生物的毒性大小主要由兩個(gè)環(huán)節(jié)所決定：一是化合物在生物體內(nèi)的富集能力；二是毒性物質(zhì)與受體物質(zhì)發(fā)生相互作用的能力[24]。已有研究顯示，綠藻門的亞心形扁藻和塔胞藻以及硅藻門的三角褐指藻和小新月菱形藻對苯并芘的耐受性較高，其96h EC50均大于1mg·L-1，而硅藻門的牟氏角毛藻及金藻門的塔溪堤等鞭金藻和湛江等鞭金藻對苯并芘非常敏感，96h EC50分別為83.06、25.18和17.00μg·L-1[25]。多氯聯(lián)苯對錐狀斯氏藻的96h EC50為0.103mg·L-1，而對熱帶骨條藻的96h EC50只有0.009mg·L-1，兩者相差10倍[26]。多溴聯(lián)苯醚(BDE-47)對海水小球藻的96h EC50為0.79μg·L-1，對牟氏角毛藻、中肋骨條藻和赤潮異彎藻的96h EC50分別為1.52、1.95和2.25μg·L-1[27]。相比這些污染物，本研究TBBPA對7種海洋微藻的96h EC50均在mg級，其毒性相對來說比苯并芘、多氯聯(lián)苯和多溴聯(lián)苯醚要低。

Kuch等[28]研究表明，德國巴登-符騰堡州某污水處理廠表層水體中TBBPA含量為0.2～20.4ng·L-1。Yang等[29]研究了巢湖水環(huán)境及沉積物中TBBPA的時(shí)空分布，發(fā)現(xiàn)TBBPA在湖水中的含量在7月達(dá)到最大值4.87μg·L-1，2008年3月巢湖沉積物中TBBPA含量達(dá)到最大值為518ng/g。張普青等[30]測定了巢湖中TBBPA的水平,在已監(jiān)測到環(huán)境沉積物、水體樣品中TBBPA含量分別為21.96～481.80ng/g和0～4.77μg·L-1,并且TBBPA含量隨著水華爆發(fā)而增大。張琳等[31]在環(huán)渤海區(qū)域20個(gè)采樣點(diǎn)水體中均檢測到TBBPA存在，其含量為38.97～672.64ng·L-1。不借助DMSO等助溶劑，TBBPA在水中的溶解度大約為4.16mg·L-1(25℃)?；谝延械难芯拷Y(jié)果，目前水體中TBBPA污染水平還不足以對微藻產(chǎn)生明顯的毒害。然而，由于低劑量TBBPA對微藻可能存在一定的刺激作用，海洋微藻長期暴露于低劑量的TBBPA是否會(huì)對海洋微藻種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，以及TBBPA通過食物鏈由微藻向高營養(yǎng)級傳遞而造成的生物放大效應(yīng)、TBBPA與其他海洋污染物的聯(lián)合作用效應(yīng)尚不清楚。

相對于其它高等生物，單細(xì)胞微藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)者，對海洋生態(tài)環(huán)境的變化更為敏感。而微擬球藻和牟氏角毛藻是本實(shí)驗(yàn)中對TBBPA最敏感的2種海洋微藻,可以作為海洋環(huán)境中TBBPA檢測的潛在生物指示物。但傳統(tǒng)的急性毒性實(shí)驗(yàn)的96h EC50只能在細(xì)胞層面上對TBBPA毒性進(jìn)行評價(jià),有必要在生理生化和基因表達(dá)層面對TBBPA毒性進(jìn)一步評價(jià)。

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責(zé)任編輯 朱寶象

The Acute Toxicity of TBBPA on Seven Marine Microalgae

DENG Jie-Ping, LI Yun, PAN Lu-Qing

(The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The acute toxicity of TBBPA on seven marine microalgae (Nannochloropsisoculata,Pyramimonassp. ,Platymonassubcordiformis,Chaetocerosmuelleri,Phaeodactylumtricornutum,IsochrysiszhanjiangensisandTahitianIsochrysisgalbana) was determined in this study. The results showed that the sensitivity of seven marine microalgae to TBBPA was different. An obvious time-dose effect was documented. The 96h EC50ofC.muelleri,N.oculata,TahitianI.galbana,I.zhanjiangensis,Pyramimonassp. was 2.59mg·L-1, 2.64mg·L-1, 4.23mg·L-1, 4.35mg·L-1, 6.71mg·L-1, respectively, indicating that TBBPA was highly toxic to microalgae. The 96 h inhibition rate ofP.tricornutumwas 22.84% when the concentration of TBBPA was 9.83mg·L-1. The 96h inhibition rate ofP.subcordiformiswas only 14.11% when the concentration of TBBPA was 14.6 mg/L.C.muelleriandN.oculatawere the most sensitive microalgae to TBBPA, which promised to be the biological indicators of TBBPA.

tetrabromobispherol A; marine microalgae; acute toxicity; 96h EC50

國家海洋局海洋公益項(xiàng)目(201105013-3)資助

2013-10-15；

2014-05-14

鄧結(jié)平(1989-)，男，碩士生，主要從事微藻毒理學(xué)研究。E-mail：djp81312982@163.com

?? 通訊作者： E-mail: sxsdlwl@ouc.edu.cn

S917

A

1672-5174(2015)02-054-06

10.16441/j.cnki.hdxb.20130377