吳 凡，孫 林，張曉明，焦新安

基于流式細(xì)胞術(shù)診斷結(jié)核感染的研究進(jìn)展

吳 凡1,2，孫 林1，張曉明2，焦新安1

結(jié)核病是危害人類健康的一種傳染病，快速診斷與合理治療是控制結(jié)核病的關(guān)鍵，然而對于潛伏性結(jié)核感染仍缺少診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。目前，結(jié)核菌素皮試以及IFN-γ釋放試驗被視為診斷是否感染結(jié)核的有效方法，它們通過間接檢測受試者對結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞免疫反應(yīng)做出評判，但這兩種方法均存在缺陷，也無法明確區(qū)分潛伏性感染和活動性結(jié)核。流式細(xì)胞術(shù)作為一項高新技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)臨床領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來，流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子技術(shù)在結(jié)核感染的診斷及療效評價等方面取得了一定進(jìn)展。本文對應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行結(jié)核感染診斷的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

結(jié)核；診斷；γ-干擾素；流式細(xì)胞術(shù)

結(jié)核病至今仍是嚴(yán)重危害人類健康的全球性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，每年約有800多萬新增病例，150多萬人死于該病[1]。流行病學(xué)模型表明只有實行有效的疫苗政策、對結(jié)核感染者以及發(fā)病者進(jìn)行準(zhǔn)確診斷和高效治療，才有望徹底消除結(jié)核病[2]。結(jié)核分枝桿菌是一種細(xì)胞內(nèi)緩慢生長的致病性微生物，也是人類結(jié)核病的病原體，感染初期，大多數(shù)人的天然防御機(jī)制會起到保護(hù)宿主清除病原體的作用，但作為胞內(nèi)寄生菌，結(jié)核分枝桿菌往往可以借助復(fù)雜的逃逸機(jī)制來逃脫巨噬細(xì)胞的殺傷并在細(xì)胞內(nèi)長期存在。人們通常將那些沒有表現(xiàn)臨床癥狀的潛伏感染者視作不具有傳染威脅，然而潛伏感染者仍有可能發(fā)展成活動性患者，所以對潛伏感染者的診斷治療是有效降低發(fā)病風(fēng)險、控制結(jié)核的關(guān)鍵所在。結(jié)核潛伏感染者并不表現(xiàn)出臨床癥狀，細(xì)菌呈現(xiàn)休眠狀態(tài)，所以對于潛伏感染的診斷難度較大。近年發(fā)現(xiàn)，由于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)并發(fā)、與結(jié)核病人親密接觸或者藥物治療導(dǎo)致免疫下降等原因，潛伏感染者發(fā)展成結(jié)核病人的風(fēng)險不斷提高，這就對結(jié)核病的早期診斷提出了更高要求。

目前用于結(jié)核病診斷的方法主要有胸部X光攝片、細(xì)菌培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮試(tuberculin skin test, TST)和IFN-γ釋放試驗(interferon-γ release assays, IGRAs)。傳統(tǒng)的檢測方法周期長、檢出率低、漏診率高，導(dǎo)致結(jié)核菌繼續(xù)傳播和病人治療延誤。TST和IGRAs以宿主發(fā)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)作為間接診斷的標(biāo)志，卻無法區(qū)分潛伏感染和活動性結(jié)核病，也尚不能判定結(jié)核感染的具體階段，對于免疫缺陷的病人TST和IGRAs檢測的敏感性都有所降低[3]。隨著流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)在臨床檢驗中的應(yīng)用與推廣，以FCM為基礎(chǔ)檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子的技術(shù)手段在結(jié)核診斷及療效評估等方面顯現(xiàn)出誘人的前景。

1 FCM檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子技術(shù)

細(xì)胞因子即那些可調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織存活、生長、分化以及功能的分泌性蛋白，一種細(xì)胞因子通常會參與體內(nèi)多種生物反應(yīng)，并且在大多情況下協(xié)同發(fā)揮功能效應(yīng)。細(xì)胞因子在對抗傳染性病原體的天然免疫保護(hù)中有著重要的作用，是機(jī)體主要的細(xì)胞免疫防御機(jī)制，在不同疾病狀態(tài)或免疫狀態(tài)下的T細(xì)胞效應(yīng)通常與細(xì)胞因子基因表達(dá)和/或分泌的相對比例相關(guān)聯(lián)[4]。早期分析單個細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的方法有酶聯(lián)免疫斑點檢測(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和原位雜交等，但均存在費時耗財?shù)牧觿輀5]，近年來有研究者開始嘗試運用FCM分析細(xì)胞因子。

FCM是對處于液流中的細(xì)胞或其他各種微粒進(jìn)行多參數(shù)快速分析和分選的技術(shù)，可以對細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中的蛋白、細(xì)胞因子、其他各種特異標(biāo)志以及細(xì)胞核中的核酸蛋白進(jìn)行分析。自20世紀(jì)80年代后期，隨著流式細(xì)胞儀的發(fā)展和熒光素標(biāo)記抗體的開發(fā)，F(xiàn)CM已普遍應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、臨床檢驗學(xué)等眾多領(lǐng)域。FCM能通過細(xì)胞內(nèi)免疫熒光染色，直接檢測與細(xì)胞因子特異性結(jié)合的抗體，快速測定出細(xì)胞亞群產(chǎn)生的細(xì)胞因子并加以定量分析，同時不會受細(xì)胞濃度、受體溶解等因素的影響。其方法是在抗原刺激細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子時用蛋白轉(zhuǎn)運阻斷藥物擾亂高爾基體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，使細(xì)胞因子在細(xì)胞質(zhì)中積累，再通過固定使細(xì)胞保持形態(tài)，破膜劑使流動的、完整的細(xì)胞膜產(chǎn)生小孔以利于抗體進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞因子抗體穿過細(xì)胞膜與胞內(nèi)細(xì)胞因子特異性結(jié)合，即可用FCM進(jìn)行檢測。FCM檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子技術(shù)，為抗原刺激后特異性淋巴細(xì)胞的功能評估提供了獨一無二的平臺，有利于揭示免疫系統(tǒng)在疾病發(fā)病機(jī)理中的作用，同時也為臨床早期診斷和治療提供重要依據(jù)。

2 FCM檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子技術(shù)對結(jié)核感染的診斷研究

利用FCM檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子技術(shù)(intracellular cytokine flow cytometry,ICC)進(jìn)行結(jié)核感染診斷的原理是：IFN-γ是介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，被結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞再次受到相關(guān)抗原刺激后會釋放IFN-γ[6-7]，通過檢測分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，可以判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌。早期分泌抗原靶標(biāo)6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)由BCG和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中普遍缺失的RD1區(qū)域編碼[8]，具有較高的特異性，所以常用作結(jié)核檢測實驗的刺激抗原。

3 FCM檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子技術(shù)的應(yīng)用評估

4 FCM區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏感染的探索

結(jié)核菌素皮試以及IFN-γ釋放試驗被視為診斷是否感染結(jié)核的有效方法,但也無法明確區(qū)分潛伏性感染和活動性結(jié)核，隨著流式細(xì)胞術(shù)的價值體現(xiàn)，研究者們嘗試從中找到一些新的啟發(fā)。

目前，很多報道提出脂阿拉伯甘露糖(Lipoarabinomanna,LAM)、16 kDa和38 kDa等結(jié)核抗原蛋白，在檢測結(jié)核病患者方面均有較高的敏感性和特異性，展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。但目前這些蛋白作為結(jié)核特異性抗原用于流式檢測的研究并不多，這或許為FCM技術(shù)在結(jié)核領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。

結(jié)核帶給人類的損失是不可估量的，而對于其早期診斷，目前尚無統(tǒng)一的金標(biāo)準(zhǔn)，相比于PPD試驗，IGRAs的特異性和敏感性均有明顯的提升，但在某些復(fù)雜情況下仍無法給出準(zhǔn)確的診斷。流式細(xì)胞術(shù)不僅可以同時檢測多種細(xì)胞因子，還可以確定產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞亞型，是一種相對快速準(zhǔn)確定量細(xì)胞因子的方法，雖然胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)在結(jié)核領(lǐng)域的應(yīng)用國內(nèi)尚未普及，隨著FCM的廣泛應(yīng)用，很有希望發(fā)展成為一種新的結(jié)核感染診斷工具，并且在生物學(xué)領(lǐng)域有著巨大的潛在價值。

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Tuberculosis diagnosis based on Flow Cytometry

WU Fan1,2,SUN Lin1,ZHANG Xiao-ming2,JIAO Xin-an1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China;2.InstitutPasteurofShanghai,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,China)

Tuberculosis (TB) is an infectious disease endangering people’s health around the world, and diagnosis and rational treatment are the key to control TB. However, currently there is no diagnostic golden standard for latent tuberculosis infection (LTBI). The tuberculin skin test and IFN-gamma release analysis are regarded as effective methods for TB diagnosis, which is based on host’s cellular immune response to mycobacterial antigens. But the two methods are not perfect; neither test can make a clear distinction between latent infection and active TB. Flow Cytometry (FCM) has been widely used in the field of clinical medicine. In recent years, substantial advances have been achieved in the fields of TB diagnosis and evaluation of treatment efficacy by using the FCM intracellular cytokine detection technology. In this paper, we will review the latest progress in tuberculosis diagnosis research by using flow cytometry in recent years.

tuberculosis; diagnosis; IFN-γ; flow cytometry

s:Jiao Xin-an, Email:jiao@yzu.edu.cn

國家青年科學(xué)基金(31201882)，江蘇省高校自然科學(xué)基金(12KJB230001)和中國科學(xué)院對外合作重點項目資助(No. GJHZ201312)聯(lián)合資助

焦新安，Email:jiao@yzu.edu.cn

1.揚州大學(xué)，江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室，江蘇省重要動物疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009； 2.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海 200031

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.014

R378.91

A

1002-2694(2015)10-0963-04

2015-03-30；

2015-08-09

Supported by the National Science Foundation for Young Scientists of China (No. 31201882) , the Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (No. 12KJB230001), and the External Cooperation Program of Chinese Academy of Sciences (No. GJHZ201312).