楊鳳嬌，周必英

豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗構建及其表達

楊鳳嬌，周必英

目的 構建豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗，研究TSOL18基因在BCG中的表達情況。方法 通過酶切的方法從重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18獲取豬帶絳蟲TSOL18基因，將其定向克隆到大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒pMV261中，構建豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18，進行酶切、PCR和測序鑒定；再將其電穿孔轉(zhuǎn)化入BCG，構建豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗,進行PCR鑒定；SDS-PAGE和Western blot分析TSOL18基因在BCG中的表達情況。結果 通過酶切成功獲得了393 bp的TSOL18基因片段；酶切、PCR和測序鑒定證明成功構建了豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18；PCR鑒定證實豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18成功轉(zhuǎn)入BCG中，提示豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗構建成功；SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在相對分子質(zhì)量(Mr)約為14.7 kD處有明顯的TSOL18目的蛋白條帶，Western blot證實表達的TSOL18目的蛋白能被兔抗血清和囊蟲病豬血清所識別。結論 成功構建了豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗，TSOL18基因能夠在BCG中成功表達，表達的TSOL18重組蛋白具有特異的抗原性，為該疫苗的進一步研究奠定了基礎。

豬帶絳蟲；重組BCG-TSOL18疫苗；構建；表達

豬囊尾蚴病(cysticercosis cellulosae)是由豬帶絳蟲(Taeniasolium)的續(xù)絳期幼蟲豬囊尾蚴寄生于人或豬引起的一種嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的人獸共患寄生蟲病，該病呈世界性分布，在我國主要流行于東北、華北、西北及西南等地區(qū)，全國囊蟲病患者約200萬～300萬，感染率達0.14%～3.20%[1]。由于該病的化療存在嚴重的毒副作用和耐藥性，外科手術治療需要掌握合適的手術時機和適應癥[2]，使得研制有效的疫苗防治該病已成為當前研究熱點。

TSOL18基因存在于豬帶絳蟲六鉤蚴中，具有較好的免疫原性和抗原性，是最具前景的豬帶絳蟲疫苗候選分子[3-4]。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是一種減毒牛型分枝桿菌，廣泛用于結核病的預防。隨著基因工程技術的發(fā)展，選擇具有安全性和免疫佐劑作用的BCG作為載體，已在細菌、病毒、腫瘤、寄生蟲等領域構建了一系列重組BCG疫苗[5-8]。而就寄生蟲領域，尚未見豬帶絳蟲重組BCG疫苗的報道。因此，本研究擬通過酶切的方法從豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18[9]獲得豬帶絳蟲TSOL18目的基因，將其定向克隆到大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒pMV261中，構建豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18，再將其電轉(zhuǎn)入BCG，構建豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗，研究TSOL18基因在BCG中的表達情況，從而為豬囊尾蚴病的防治提供一種新型疫苗。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18和兔抗血清由本課題組前期制備保存[9]；質(zhì)粒pMV261購自美國Addgene公司；大腸埃希菌(E.coli)DH5α、兔抗TSOL18血清和囊蟲病豬血清由本室保存；BCG凍干粉由遵義市疾病預防控制中心提供；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自美國AXYGEN公司；Taq DNA Polymerase、BamH I、EcoR I、T4DNA連接酶、DNA Marker和蛋白Marker購自日本Takara公司；Middle Brook 7H9 Broth(M7H9)培養(yǎng)基、偶氮甲酰胺(Ablumin-dextrose complex ,ADC)Enrichment購自美國Difco公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。核酸/蛋白電泳裝置購自北京六一儀器廠；PCR儀購自美國MJ-Research公司。

1.2 質(zhì)粒pMV261的擴增與鑒定 制備E.coliDH5α感受態(tài)細胞，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，冰浴5 min，冷卻后加入400 μL Luria-Bertanig(LB)培養(yǎng)液，37 ℃ 200 r/min振搖1 h，離心，棄上清后，以100 μL LB培養(yǎng)液重懸菌液，取重懸菌液混勻涂布含50 μg/mL卡那霉素(kana)的LB瓊脂平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落至含50 μg/mL Kana的LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 250 r/min振搖培養(yǎng)4 h，待菌液渾濁后備用，質(zhì)粒小量快速抽提并純化，進行質(zhì)粒測序及酶切鑒定。

1.3 豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18的構建及鑒定 將本室制備保存的重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18[9]和鑒定正確的質(zhì)粒pMV261分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收相應片段后用T4DNA連接酶16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒，進行酶切、PCR及測序鑒定。

1.4 BCG感受態(tài)細菌的制備 將BCG凍干粉用無菌水溶解后取1 mL接種于含有10% ADC的M7H9-Tween80液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至菌體OD600達0.5～1.0對數(shù)生長期；冰浴2.5 h, 5 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用預冷的10%甘油清洗2次；再用初始培養(yǎng)物1/20體積預冷的10%甘油，重懸混勻，100 μL每管分裝于預冷的1.5 mL離心管中；此細菌可立即用于電轉(zhuǎn)化，或者-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18電轉(zhuǎn)化BCG感受態(tài)細菌 取備用的重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18 5～15 μg與BCG感受態(tài)細菌100 μL充分混勻，冰浴10 min后轉(zhuǎn)移至0.1 cm電轉(zhuǎn)杯中，電擊參數(shù)設置為：電壓1.8 kV、間隔800 ms、脈沖150 μs，共35次，其中轉(zhuǎn)化時間5 ms；電轉(zhuǎn)化后立即加入1 mL的M7H9ADC液體培養(yǎng)基，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至玻璃試管內(nèi)，37 ℃ 80 r/min振蕩培養(yǎng)5 h；取100 μL涂布于含有25 μg/mL Kana的M7H9ADC固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)約4～6周，篩選陽性菌落。

1.6 豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗的PCR鑒定 挑取上述M7H9ADC固體培養(yǎng)基中的單個菌落至含有25 μg/mL Kana的M7H9ADC液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約1.0；取1 mL菌液，10 000 r/min離心10 min；棄上清，ddH2O洗滌3次，10 000 r/min離心棄上清,加入30 μL的ddH2O，重懸后沸水浴10 min；冰浴2 min，10 000 r/min離心10 min；吸取上清作為PCR模板，進行PCR鑒定。用于PCR鑒定的引物為P1(5′-ATGGTGTGTCGGTTTGCTCTCAT-3′)和P2(5′-CTACGATCTTCGGACCTTCTTGTG-3′)，引物由南京鐘鼎生物公司合成。反應體系為：以P1、P2為引物各1 μL，1 μL菌液為模板，10×Buffer (plus Mg2+)5 μL，dNTP Mixture 5 μL，Taq DNA Polymerase 1 μL,ddH2O 36 μL；PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s,50 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)擴增35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7 重組BCG-TSOL18疫苗的誘導表達 將經(jīng)PCR鑒定含有pMV261-TSOL18質(zhì)粒的rBCG接種于M7H9ADC液體培養(yǎng)基中；37 ℃培養(yǎng)約4周至對數(shù)生長期；收集菌體前3 d，每天45 ℃熱誘導45 min，每天1次，共3次。

1.8 SDS-PAGE鑒定 取1 mL熱誘導后的rBCG菌液，6 000 r/min，4 ℃離心15 min收集細菌，將BCG懸浮于預冷的PBS中；在冰浴中超聲裂解20 min；加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴4～8 min，取30 μL作SDS-PAGE分析,用R250考馬斯亮藍染色,甲醇/冰乙酸脫色。

1.9 Western blot分析 將菌體蛋白作SDS-PAGE后，用濕法轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF上，于封閉液中室溫搖床封閉2 h，用PBS漂洗5 min,用1∶1 000稀釋的兔抗TSOL18血清及1∶200稀釋的囊蟲病豬血清4 ℃封閉過夜，37 ℃ PBST漂洗3次，每次5 min；用1∶1 500稀釋的HRP標記鼠抗兔血清及鼠抗豬血清37 ℃孵育1 h，37 ℃ PBST漂洗4次，每次5 min，用ECL顯色劑與PVDF膜避光反應3 min，曝光后進行Western blot分析。

2 結 果

2.1 質(zhì)粒pMV261的鑒定 擴增的質(zhì)粒pMV261小量抽提后經(jīng)Hind III單酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小約為4 500 bp單一直鏈條帶，與4 488 bp的pMV261大小一致，驗證其確為pMV261，見圖1；質(zhì)粒經(jīng)測序，通過與pMV261官方標準序列比對，匹配度為100%，驗證其確為pMV261。

M:DNA Marker; 1:Plasmid pMV261; 2:Restriction enzyme analysis of pMV261 withHind III.

圖1 空質(zhì)粒pMV261單酶切鑒定

Fig.1 Identification of restriction analysis of the plasmid pMV261

2.2 TSOL18目的基因的獲取 重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到4 944 bp的pGEX-1λT載體片段和393 bp的TSOL18目的基因片段，與預期結果相符，見圖2。

M:DNA Marker; 1:Restriction enzyme analysis of the pGEX-TSOL18 withBamHⅠ/EcoRⅠ.

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18雙酶切鑒定

Fig.2 Identification of restriction analysis of the recombinant plasmid pGEX-TSOL18

2.3 豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18的酶切鑒定 重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，用l%瓊脂糖凝膠電泳，得到4 488 bp的pMV261載體片段和393 bp的TSOL18基因片段，與預期結果相符，見圖3。

M:DNA Marker; 1:Production of restriction enzyme of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18.

圖3 重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18的雙酶切鑒定

Fig.3 Identification of restriction enzyme of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18

2.4 豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18的PCR鑒定 以含質(zhì)粒pMV261-TSOL18的重組菌為模板進行PCR，經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳后得到393 bp的TSOL18目的基因，與預期結果相符，見圖4；質(zhì)粒經(jīng)測序，通過與TSOL18基因標準序列比對，匹配度為100%，證實獲得的TSOL18基因正確地插入到pMV261載體的BamHⅠ/EcoRI之間，與預期結果相符。

2.5 豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗的PCR鑒定 以含重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18的BCG轉(zhuǎn)化菌為模板進行PCR，其中1、3、4、5、7泳道為rBCG陽性菌的PCR產(chǎn)物，可得到393 bp的TSOL18 基因片段，與預期結果相符，見圖5。

M:DNA Marker; 1:PCR product of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18.

圖4 重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18的PCR鑒定

Fig.4 PCR identification of the recombinant plasmid pMV261-TSOL18

M:DNA Marker; 1,3,4,5,7:PCR production of rBCG positive bacteria; 2,6:PCR production of rBCG negative bacteria.

圖5 豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗的PCR鑒定

Fig.5 PCR identification of the recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasolium

2.6 重組BCG-TSOL18疫苗表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 rBCG培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，經(jīng)45 ℃熱誘導后進行SDS-PAGE電泳，在Mr為14.7 kD處可見明顯的表達條帶，與393 bp的TSOL18基因編碼130個氨基酸的理論分子質(zhì)量基本相符，結果見圖6。

2.7 重組BCG-TSOL18疫苗表達產(chǎn)物的Western blot分析 重組BCG-TSOL18疫苗表達產(chǎn)物與兔抗血清、囊蟲病豬血清反應后，在Mr約為14.7 kD處出現(xiàn)明顯的反應帶，結果見圖7A、B。

3 討 論

TSOL18基因是Gauci等[10-11]從豬帶絳蟲六鉤蚴cDNA文庫中分離得到的一個長度為579 bp片段,其中390 bp可編碼相對分子質(zhì)量(Mr)為14.7 kDa的含130個氨基酸的蛋白質(zhì)。該基因相對保守，存在于激活的豬帶絳蟲六鉤蚴中，具有較好的免疫原性和抗原性，在豬帶絳蟲六鉤蚴入侵小腸絨毛上皮的過程中起重要作用，是最具開發(fā)價值的疫苗候選抗原之一。隨后國內(nèi)外學者相繼進行了TSOL18基因的重組蛋白疫苗、DNA疫苗、重組酵母疫苗、重組鼠傷寒沙門氏桿菌疫苗的研究[12-15]，但是人們發(fā)現(xiàn)重組蛋白疫苗需要經(jīng)過基因克隆、表達和蛋白純化等復雜過程，技術難度大，成本較高，同時它只能誘導體液免疫和Th細胞應答，不能誘導細胞毒性T淋巴細胞應答(CTL)；DNA疫苗操作簡單，能同時誘導體液免疫、Th細胞和CTL應答，但DNA可整合到宿主細胞的基因組中，有引起原癌基因活化和抑制基因失活的危險；重組畢赤酵母中表達蛋白存在過度糖基化，可能影響重組蛋白的合成與分泌，且糖基化后的蛋白具有高度異質(zhì)性，會使重組蛋白發(fā)生功能改變[16]；鼠傷寒沙門氏桿菌屬于革蘭陰性菌，其在體內(nèi)表達產(chǎn)生的脂多糖毒素可能對宿主細胞有毒性，可能會干擾編碼基因在宿主細胞中的正確表達和合成，并且存在細菌毒力返強的危險性。針對以上疫苗存在的不足，因此，有必要研究新型的豬帶絳蟲疫苗。

M:Protein Marker; 1-3:Expression production of rBCG induced by heating; 4:BCG control.

圖6 TSOL18基因在BCG中表達的SDS-PAGE鑒定

Fig.6 SDS-PAGE identification of TSOL18 expression in BCG

1-3:TSOL18 protein reacted with rabbit antiserum (A)or cysticercosis swine serum(B); 4:BCG control.

圖7 TSOL18基因在BCG中表達的Western blot鑒定

Fig.7 Western blot identification of TSOL18 expression in BCG

BCG是一種減毒牛型分支桿菌，是目前唯一用于預防結核病的疫苗。因其具有安全性和免疫佐劑作用，隨著基因工程技術的發(fā)展，選擇BCG作為載體構建疫苗的研究越來越受重視。該疫苗具有以下優(yōu)點：①BCG不僅是抗結核病的活疫苗，而且是一種強免疫佐劑，主要介導細胞免疫應答，也能誘導體液免疫應答，BCG分泌的胞外蛋白可能在誘導細胞介導的保護性免疫反應中起重要作用，所表達的靶抗原不需純化，可直接用于免疫保護試驗，免去了蛋白質(zhì)后處理的復雜工序；②BCG是活菌苗，在體內(nèi)不斷表達外源抗原，用單次接種即可持續(xù)誘導對靶抗原的免疫反應，免疫持久，可提高宿主的免疫力；③BCG用于人是安全的，它是WHO推薦的兩種出生時即可接種的活疫苗之一，生產(chǎn)成本較低，熱穩(wěn)定性強，易于保存；④經(jīng)口服可誘導有效的黏膜免疫，是一種極具吸引力的活疫苗載體[17-18]。因此，選擇BCG作為載體構建豬帶絳蟲的重組BCG疫苗，可能是預防和控制豬囊尾蚴病的一種較安全可靠的新型疫苗。

為了將外源DNA有效引入BCG，本研究選用了大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體pMV261。該質(zhì)粒添加了aph基因(即卡那霉素抗性標記)、多克隆位點、分枝桿菌強啟動子熱休克蛋白60(hsp60)和轉(zhuǎn)錄終止子，發(fā)現(xiàn)pMV261均能在大腸桿菌和結核桿菌中正常表達，具有高拷貝、高表達重組蛋白以及對BCG基因組的非破壞性等優(yōu)點[19-20]。本研究在前期構建豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18的基礎上，采用酶切的方法從該質(zhì)粒中成功獲得了393 bp的TSOL18目的基因，將其定向克隆到大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體pMV261中，構建豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18，經(jīng)雙酶切、PCR和測序鑒定，證實TSOL18基因成功插入pMV261中；然后將重組質(zhì)粒pMV261-TSOL18電穿孔轉(zhuǎn)化BCG，構建豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗，以從具有卡那霉素抗性的M7H9ADC液體培養(yǎng)基中篩選陽性菌液為模板進行PCR鑒定，證實豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗構建成功。

外源基因在rBCG中的有效表達是疫苗發(fā)揮作用的基礎。本文用SDS-PAGE分析rBCG疫苗的表達產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)含pMV261-TSOL18的rBCG菌經(jīng)熱誘導后，在Mr約為14.7 KD處有明顯的目的蛋白條帶，與預期結果相符；Western blot顯示表達的目的蛋白能被兔抗TSOL18血清和囊蟲病豬血清所識別，而BCG菌無目的蛋白條帶，提示TSOL18基因能夠在BCG中成功表達，且表達的蛋白具有特異的抗原性，為該疫苗的進一步研究奠定了基礎。

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Construction and expression of a recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasolium

YANG Feng-jiao,ZHOU Bi-ying

(DepartmentofParasitology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

We constructed a recombinant Bacillus Calmette-Guerin(BCG)-TSOL18 vaccine ofTaeniasoliumand observed the expression of the TSOL18 gene in BCG. The TSOL18 gene ofTaeniasoliumwas obtained from the recombinant plasmid pGEX-TSOL18 by digestion method and cloned intoEscherichiacoli(E.coli)-mycobacterium shuttle plasmid pMV261 to construct the recombinant plasmid pMV261-TSOL18 ofTaeniasolium, and the recombinant plasmid was identified by restriction enzyme digestion, PCR and DNA sequencing. Then, the recombinant plasmid was transformed into BCG by electroporation to construct the recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasolium, and the vaccine was identified by PCR. The expression of the TSOL18 gene in BCG was identified by SDS-PAGE and Western blot. The 393 bp TSOL18 gene fragment was successfully obtained by restriction enzyme digestion. Restriction enzyme digestion, PCR and DNA sequencing suggested that the recombinant plasmid pMV261-TSOL18 ofTaeniasoliumwas successfully constructed. PCR confirmed that the recombinant plasmid pMV261-TSOL18 ofTaeniasoliumwas successfully transformed into BCG, suggesting that the recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasoliumwas successfully constructed. SDS-PAGE showed that the relative molecular mass (Mr) of TSOL18 target protein was approximately 14.7 kD. Results of western blot showed the TSOL18 target protein could be recognized by rabbit antiserum or cysticercosis swine serum. The recombinant BCG-TSOL18 vaccine ofTaeniasoliumwas successfully constructed. The TSOL18 gene ofTaeniasoliumwas successfully expressed in BCG and the expressed TSOL18 recombinant protein had specific antigenicity. This result would lay a foundation for further study of the vaccine.

Taeniasolium; recombinant BCG-TSOL18 vaccine; construction; expression

Zhou Bi-ying,Email:zbyzl01@126.com

周必英，Email：zbyzl01@126.com

遵義醫(yī)學院寄生蟲學教研室，遵義 563000

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.012

R383.33

A

1002-2694(2015)10-0952-05

2015-01-26；

2015-07-28

貴州省科技廳社會發(fā)展攻關項目(黔科合SY字[2011]3038號)

Supported by the Social Research Project of Science and Technology Department of Guizhou Province (No.SY [2011]3038)