翁幸鐾，糜祖煌，周鐵麗

氣單胞屬菌糞便分離株分子鑒定與耐藥元件檢測

翁幸鐾1，2，糜祖煌3，周鐵麗1

目的 調(diào)查一組14株氣單胞屬菌的菌種分子鑒定情況，以及β-內(nèi)酰胺酶類、氨基糖苷類耐藥的遺傳學(xué)背景。方法 14株氣單胞屬菌均分離自2012年1月至12月寧波市第一醫(yī)院腸道門診腹瀉患者的糞便標(biāo)本，再作通用引物16SrDNA測序比對判定菌種，然后用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法分析23種β-內(nèi)酰胺酶基因、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標(biāo)記。結(jié)果 本組14株菌經(jīng)16SrDNA測序比對,10株為嗜水氣單胞菌, 水簇箱氣單胞菌、溫和氣單胞菌、腸棕氣單胞菌、斑點氣單胞菌各1株。14株氣單胞菌共檢出5種β-內(nèi)酰胺酶基因、4種氨基糖苷類修飾酶基因和3種可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記基因。其中4號株(嗜水氣單胞菌)AQU基因是新的基因亞型，命名為AQU-2, 11號株(水簇箱氣單胞菌)AQU基因也是新的基因亞型，命名為AQU-3。結(jié)論 氣單胞菌屬的菌種鑒定應(yīng)該以分子鑒定法為準(zhǔn)。本組14株氣單胞屬菌耐藥嚴(yán)重，已呈多重耐藥。

氣單胞屬菌；分子鑒定；耐藥基因；基因亞型；可移動遺傳元件

氣單胞屬菌(Aeromonas)為革蘭氏陰性短桿菌，屬內(nèi)已被命名的菌種已超過20種。氣單胞屬菌為條件致病菌，是典型的人—獸—魚共患病原菌。氣單胞屬菌可致宿主腸道疾病和腸外疾病。最近，我們從人糞便中分離到一組經(jīng)儀器鑒定為氣單胞屬菌,為了確認(rèn)菌種進(jìn)一步作了16SrDNA測序比對(即菌種分子鑒定)。并進(jìn)行了23種β-內(nèi)酰胺酶基因、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標(biāo)記檢測,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 14株菌均為分離自寧波市第一醫(yī)院腸道門診腹瀉患者的糞便標(biāo)本,經(jīng)法國bioMerieux公司Vitek 2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套革蘭陰性菌鑒定卡進(jìn)行菌株鑒定為氣單胞屬菌。

1.2 細(xì)菌分子鑒定 14株菌均作通用引物16SrDNA測序,測得序列上網(wǎng)比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)判定菌種。16SrDNA擴(kuò)增與測序引物序列為:P1:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; P2:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′[1]。16SrDNA PCR試劑盒和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

1.3 藥敏試驗 采用法國生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀及配套革蘭陰性菌藥敏卡進(jìn)行藥物敏感性檢測。再根據(jù)2014年美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗菌藥物敏感性判斷。

1.4 細(xì)菌基因檢測模板處理 挑取單個菌落，置入0.5 mL的eppendorf離心管(管內(nèi)預(yù)置濃度為200 μg/L的蛋白酶K溶液400 μL),加蓋后放置56 ℃水浴2 h,然后放置95 ℃水浴10 min?；驒z測模板即完成,模板液放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因檢測 23種β-內(nèi)酰胺酶基因(包括A類、C類、D類β-內(nèi)酰胺酶基因, B類β-內(nèi)酰胺酶基因因本組菌株無碳青霉烯類藥物耐藥株故未作檢測)、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標(biāo)記檢測均為PCR法。PCR靶基因引物識別序列和目的產(chǎn)物長度見表1。各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為:每反應(yīng)體系P1引物1 μL(1.0 μmol/L)、P2引物1 μL(1.0 μmol/L),dNTPs 2 μL(2 mmol/L), 10倍緩沖液2 μL(KCl 10 mmol/L,(NH4)2SO48 mmol/L，MgCl22 mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10 mmol/L，NP400.5%，BSA 0.02%(wt/vol))，Taq DNA pol 1U(不計體積),超純水9 μL, 模板液5 μL,總反應(yīng)體積20 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物>500 bp熱循環(huán)參數(shù)均為：93 ℃預(yù)變性2 min，然后93 ℃60 s→55 ℃60 s→72 ℃60 s，循環(huán)35周期，最后一個72 ℃延長至5 min,其余均為：93 ℃預(yù)變性2 min，然后93 ℃30 s→55 ℃30 s→72 ℃ 60 s，循環(huán)35周期，最后一個72 ℃延長至5 min。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽性對照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽性?；驒z測試劑盒和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供(PCR引物序列由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所糜祖煌根據(jù)2013年2月1日之前已在www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide登錄的各種序列的保守區(qū)域完成設(shè)計,并獲授權(quán)使用)。

表1 靶基因引物識別序列和目的產(chǎn)物長度

表1(續(xù)表1)

表1(續(xù)表2)

1.6 陽性基因測序 PCR陽性產(chǎn)物為PCR直接全自動熒光法測序,委托上海博尚生物技術(shù)有限公司完成(測序在美國ABI公司3730型毛細(xì)管全自動測序儀上進(jìn)行)。

1.7 測得序列比對 讀序工具軟件為Chromas,測序結(jié)果用Chromas直接作BLAST Search比對, 或拼接成全長序列后作BLASTn比對。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分子鑒定結(jié)果 本組14株菌經(jīng)16SrDNA測序上網(wǎng)比對,10株為嗜水氣單胞菌(A.hydrophila),另外水簇箱氣單胞菌(A.aquariorum)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、腸棕氣單胞菌(A.enteropelogenes)、斑點氣單胞菌(A.punctata)各1株。14株氣單胞屬菌進(jìn)一步作藥敏檢測和耐藥檢測。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 14株氣單胞屬菌對抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表2。

2.3 耐藥元件檢測結(jié)果 14株氣單胞屬菌耐藥元件檢測結(jié)果與部分β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物藥敏結(jié)果見表3,表4為14株氣單胞屬菌耐藥元件檢測結(jié)果，共檢出5種β-內(nèi)酰胺酶基因、4種氨基糖苷類修飾酶基因和3種可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記基因。其中4號株(嗜水氣單胞菌)AQU基因測得1 143 bp與美國GenBank已登錄的AQU序列不同,被命名為AQU-2正在登錄美國GenBank,其中11號株(水簇箱氣單胞菌)AQU基因測得1149 bp亦與美國GenBank已登錄的AQU序列不同,被命名為AQU-3正在登錄美國GenBank。2號株(嗜水氣單胞菌)、3號株(嗜水氣單胞菌)、5號株(嗜水氣單胞菌)的aac(6’)-Ⅰb-cr序列亦正登錄美國GenBank。

3 討 論

在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域,國內(nèi)魚、蟹、鱉疾病與氣單胞菌感染的關(guān)系研究頗多。

在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，國內(nèi)主要為氣單胞菌感染導(dǎo)致腹瀉的個案報道。進(jìn)入本世紀(jì)后有幾起氣單胞菌感染導(dǎo)致群體性腹瀉的報道[2-3]，和氣單胞菌致急性白血病患者皮膚軟組織感染[4]和肝硬化患者敗血癥的個案報道[5]。除此之外，國外還報道了氣單胞菌導(dǎo)致的多種腸外感染，如傷口感染、尿路感染、肝膽道感染,軟組織感染、腦膜炎[6]，免疫缺陷兒童可引起更嚴(yán)重的溶血性尿毒綜合征(HUS)、壞死性筋膜炎[7]。

但氣單胞菌屬的菌種鑒定，常規(guī)的生化鑒定法準(zhǔn)確率不高，應(yīng)該以分子鑒定法為準(zhǔn)。本文儀器判讀為氣單胞菌的14株菌,經(jīng)16SrDNA測序比對,10株為嗜水氣單胞菌, 另外水簇箱氣單胞菌、溫和氣單胞菌、腸棕氣單胞菌、斑點氣單胞菌各1株。

表2 14株氣單胞屬菌對抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果(%)

表3 14株氣單胞菌屬耐藥元件檢測結(jié)果與部分β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類藥物藥敏結(jié)果

注：本組1-10號菌為A.hy：嗜水氣單胞菌，11號菌為A.aq：水簇箱氣單胞菌、12號菌為A.so：溫和氣單胞菌、13號菌為A.en：腸棕氣單胞菌、14號菌為A.pu：斑點氣單胞菌。因9、10、13、14號菌未檢出上述陽性基因，故未列出。未檢出陽性基因的項目亦未列出。

Cefatriaxone：頭孢曲松、Gentamycin：慶大霉素、Amikacin：阿米卡星、R：耐藥、S：敏感。

Note:The items of negative genes are not listed.

表4 14株氣單胞屬菌耐藥元件檢測結(jié)果匯總

Note:The items of negative genes are not listed.

國外的相關(guān)研究也證實了這點。Aravena-Román M等對104株生化鑒定為嗜水氣單胞菌，用分子鑒定法(rpoD+gyrB)再次鑒定，發(fā)現(xiàn)符合率只有33.6%(35/104)，其它分別為氣單胞菌屬其它菌種[8]。Figueras MJ等對150株生化鑒定為氣單胞菌屬細(xì)菌，用16S rDNA-RFLP法重新鑒定，138株(92%)證實為氣單胞菌屬各個種，仍有24株(17.5%)還是無法鑒定，繼續(xù)用rpoD+gyrB法鑒定到種[9]。Martínez-Murcia AJ等從水體和進(jìn)口觀賞魚皮膚分離到48株氣單胞菌屬細(xì)菌，用常規(guī)生化法無法鑒定到種，他們聯(lián)用gyrB+rpoD法、16S rRNA法、DNA-DNA雜交法、MALDI-TOF MS法、RAPD基因分型法來鑒定菌種[10]。

從表2可見，本組14株氣單胞屬菌耐藥嚴(yán)重，已呈多重耐藥。氣單胞屬菌特有的AQU基因是染色體介導(dǎo)的C類β-內(nèi)酰胺酶編碼基因(AmpC酶編碼基因)，最近由臺灣研究人員在達(dá)卡氣單胞菌(Aeromonasdhakensis)、嗜水氣單胞菌、水簇箱氣單胞菌中檢測到，可介導(dǎo)頭孢噻肟耐藥[11]。本組4號株(嗜水氣單胞菌)檢出了AQU-2，11號株(水簇箱氣單胞菌)檢出了AQU-3。另一種氣單胞屬菌特有的CepS/CepH基因在本組菌中未檢出。國內(nèi)在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尚無對分離株進(jìn)行分子鑒定對菌株“驗明正身”,然后進(jìn)行23種β-內(nèi)酰胺酶基因、6種氨基糖苷類修飾酶基因和6種16SrRNA甲基化酶基因以及6種可移動遺傳元件分子標(biāo)記檢測的報道。

如表3所示，檢出β-內(nèi)酰胺酶基因的菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)為不同程度的耐藥；5號、10號、13號這3株菌，未檢出β-內(nèi)酰胺酶基因，因此對β-內(nèi)酰胺類敏感。但6號、9號、14號這3株β-內(nèi)酰胺酶基因陰性的菌株，對β-內(nèi)酰胺類耐藥，推測可能存在新的β-內(nèi)酰胺酶基因。氨基糖苷類的基因型和表型對應(yīng)較好。

氣單胞菌屬細(xì)菌也攜帶了大量的毒力因子，包括溶血素、細(xì)胞興奮素、細(xì)胞毒性腸毒素、蛋白酶、脂酶、殺白細(xì)胞素、內(nèi)毒素、粘附素和S層[12]。這些毒力因子和致病力的相關(guān)性值得我們做進(jìn)一步深入研究。

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Molecular identification and resistant derterminants ofAeromonassp. isolated from stool of human

WENG Xing-bei1,2,MI Zu-huang3,ZHOU Tie-li1

(1.WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.MedicalLaboratoryDepartment,NingboFirstHospital,Ningbo315010,China;3.WuxiCloneGen-TechInstitute,Wuxi214026,China)

We investigated molecular identification of a group of 14 strains ofAeromonassp., and genetic background of resistance to beta-lactams, aminoglycosides. From January to December 2012, 14 strains ofAeromonassp. were collected from stool from diarrheal patients in enteric clinics in Ningbo First Hospital in Zhejiang Province, China. Then, molecular identification by 16SrDNA, 23 kinds of beta-lactamase genes, 6 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes, 6 kinds of 16srRNA methylase genes, and 6 kinds of mobile genetic elements were analyzed by PCR. In addition, genotyping and sample cluster analysis were performed. Results showed that 10 strains ofA.hydrophila, 1 strain ofA.aquariorum,A.sobria,A.enteropelogenes,A.punctatawere confirmed by 16SrDNA sequencing and arithmetic. Five kinds of beta-lactamase genes, 4 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes, and 3 kinds of mobile genetic elements were positive.BlaAQU of strain No.4(AQU-2) and strain No.11(AQU-3) were new subtypes. It’s suggested that identification ofAeromonassp. should be performed by molecular identification method. This group of 14 strains ofAeromonassp. conferred multidrug resistance.

Aeromonas; molecular identification; resistant determinant; subtype; mobile genetic element

Zhou Tie-li, Email:wyztli@163.com

周鐵麗，Email：wyztli@163.com

1.溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325035； 2.寧波市第一醫(yī)院檢驗科，寧波 315010； 3.無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所，無錫 214026

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.008

R378.2

A

1002-2694(2015)10-0931-07

2015-01-21；

2015-08-11

浙江省中醫(yī)藥基金(2011ZB126),寧波市自然科學(xué)基金(2012A610186)

Supported by the Traditional Chinese Medicine Foundation of Zhejiang Province (No. 2011ZB126), the Ningbo Natural Science Foundation (No. 2012A610186)