李效尊，楊百戰(zhàn)，尹靜靜，杜紹印，崔太昌，吳修

（1.山東省水稻研究所/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心，濟南，250100；2.郯城縣種子公司）

蓮（Nelumbo nuciferaGeartn.）又名水芙蓉、荷花、蓮藕等，是蓮科蓮屬多年生宿根性水生草本植物[1]。蓮在我國廣泛分布，且具有悠久的種植歷史。蓮全身是寶，兼有藥用、食用和觀賞價值。根據(jù)用途，蓮可分為子蓮、藕蓮和花蓮。蓮籽是蓮的種子，藕是蓮膨大的根狀莖，二者是蓮藕主要的食用部分。蓮藕是我國栽培面積最大的水生蔬菜[2]。

種質(zhì)資源是開展遺傳和育種研究的基礎(chǔ)，是重要的戰(zhàn)略資源。我國是開展蓮藕種質(zhì)資源和育種研究較多的國家。目前國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃保存了蓮藕種質(zhì)資源600 余份，其中多數(shù)為我國南方地區(qū)蓮藕種質(zhì)資源，北方蓮藕種質(zhì)資源相對較少。

由于特殊的構(gòu)造和生理特性，蓮籽是壽命較長的少數(shù)植物種子（果實）之一。關(guān)于古蓮籽的出土、長壽機制和利用研究報道已有不少[3，4]，古蓮的出土為研究當(dāng)?shù)貧v史地理和旅游開發(fā)提供了重要素材，也為蓮藕遺傳育種研究提供了重要種質(zhì)資源。2013 年，在梁山山體南側(cè)平原水庫的挖掘過程中，人們在距地面6.5 m 左右的泥炭層中發(fā)現(xiàn)了大量的蓮籽，這些古蓮籽經(jīng)過培育成功成苗，將其命名為梁山古蓮。為了充分挖掘梁山古蓮的歷史和生物學(xué)價值，利用碳同位素測定技術(shù)對出土蓮籽進行了斷代分析，并對其實生苗植株的生物學(xué)性狀和遺傳地位進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

梁山古蓮籽取自山東梁山縣平原水庫（梁山山體南側(cè)）施工現(xiàn)場距地面6.5 m 左右的泥炭層中。蓮籽實生苗和無性系植株種于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心飲馬泉基地。其他蓮藕材料信息見表1。

瓊脂糖、CTAB 購自上海生物工程股份有限公司；Taq 酶、RNase A 和DL2 000 DNA Marker 購 自Takara 公司；其他常規(guī)試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。PCR 儀（型號為Mastercycler AG22331）和離心機（型號為Centrifuge 5424）由德國Eppendorf 公司生產(chǎn)；電泳儀（型號JY600C）和凝膠成像系統(tǒng)（型號為JY04S-3E）由北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

表1 蓮藕材料信息

碳素測定法，C 含量由西安加速器質(zhì)譜中心測定。利用軟件Calib 7.0.2 將14C 年齡校正到公元紀年[5]。共測3 個獨立蓮籽，分別取自不同方位。

②發(fā)芽率測試 蓮籽有凹陷的一端破口后，浸種3 d，每天換水1 次。培養(yǎng)溫度：白天30℃，夜間25℃；光照時間：白天16 h，夜間8 h，光照強度為12 000 lx。

③生物性狀統(tǒng)計 將古蓮實生苗種在8 m2的水泥池中，田間管理參照常規(guī)方法。通過對2 個古蓮單株進行了2 a 的跟蹤調(diào)查，記錄開花期、株高、花莖、花色、葉片大小、藕的形狀等[6]。

④聚類分析 為了揭示梁山古蓮與山東周邊野蓮和藕蓮地方品種之間的親緣關(guān)系，利用RAPD 標(biāo)記對其與一些代表性材料（表1）進行了聚類分析。蓮藕DNA 提取和PCR 程序等參照尹靜靜等[7]的方法。

PCR 擴增完畢后， 統(tǒng)計群體中擴增清晰的RAPD 多態(tài)性條帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。 用NTSYS 2.1 軟件進行遺傳相似性分析和UPGMA 聚類圖的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 古蓮籽斷代結(jié)果

從表2 可以看出，梁山古蓮籽埋入地下的時間距今最長約為731 a，最短約為598 a，此時為我國元朝至明朝初期。此結(jié)果證明，元朝之前梁山泊的確存在

2.2 古蓮籽性狀統(tǒng)計

從5 個不同的方位進行了樣品收集，發(fā)現(xiàn)這些古蓮籽表皮絕大部分均已失去，呈現(xiàn)出光亮的淺褐色，極少數(shù)蓮籽尚殘存不完整的柱頭（圖1）。測試了古蓮籽的發(fā)芽率，發(fā)現(xiàn)其發(fā)芽率為90%～100%（表3）。統(tǒng)計了前3 個取樣點蓮籽的大小，發(fā)現(xiàn)第1 個取樣點蓮籽的長度（15.7 mm）和寬度（10.5 mm）明顯大于另外兩處（長度分別為14.9、14.5 mm；寬度分別為10.3、9.4 mm）（表3），說明古蓮群體具有多樣性。

2.3 古蓮植株主要性狀統(tǒng)計

于2013 年7 月種植了古蓮籽，并于2014 年和2015 年對其無性株系進行了2 a 的跟蹤調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示（表4），根據(jù)荷花分類標(biāo)準[8]，梁山古蓮株型達到了大株型標(biāo)準（立葉高度50 cm 以上、葉徑30 cm 以上、花徑18 cm 以上），其花蕾為紫紅色，花色為大紅色，花瓣在20 枚以內(nèi)（圖2），藕皮色為白色，形狀細長，與微山紅蓮和白洋淀紅蓮?fù)瑢儆谥袊徬荡笾晷蜕侔昙t蓮類群。梁山泊原屬于黃河流域，梁山古蓮可能是黃河流域比較有代表性的種質(zhì)資源。同時，發(fā)現(xiàn)不同梁山古蓮單株在大小上存在明顯的差異，進一步說明群體內(nèi)部存在多樣性。

2.4 古蓮與其他種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

地方品種均是從野生資源中選育而來。為了解梁山古蓮與周邊野生資源和地方蓮藕品種之間的親緣關(guān)系，對相關(guān)材料進行了RAPD 分子標(biāo)記聚類分析。結(jié)果顯示（圖3），梁山古蓮與馬踏湖白蓮、微山紅蓮和白洋淀紅蓮親緣關(guān)系較近，與馬踏湖白蓮關(guān)系最近，暗示梁山古蓮可能為當(dāng)?shù)嘏荷徠贩N的來源。

3 結(jié)論與討論

梁山因《水滸》而得名，是我國著名的旅游城市。但是，梁山泊作為歷史存在和水滸故事的附著地一直因現(xiàn)實無水而備受爭議。此次出土的蓮籽最長距今700 余a，處于我國宋金元更替時期，這為歷史上梁山泊的真實存在提供了有力的生物學(xué)證據(jù)。我國蓮文化深厚，濟南、濟寧、澳門等城市把荷花作為市花，全國每年都有許多城市舉辦荷花節(jié)[9]。古蓮作為一種奇特的資源，可以助推旅游業(yè)發(fā)展。遼寧普蘭店就以古蓮為名片，建立了千年古蓮園等旅游景點，推動了當(dāng)?shù)芈糜螛I(yè)發(fā)展。梁山可以借鑒普蘭店的做法，利用梁山古蓮發(fā)展相關(guān)旅游。

表2 梁山古蓮籽斷年結(jié)果

圖1 梁山出土古蓮籽形態(tài)

表3 梁山出土古蓮籽性狀

表4 梁山古蓮植株主要性狀

圖2 梁山古蓮開花期植株

圖3 13 份蓮藕材料UPMAG 聚類圖

生物學(xué)性狀分析表明，梁山古蓮屬于中國蓮系大株型少瓣紅蓮類群[8]，應(yīng)為我國黃河流域代表性的野蓮資源。 歷史記載，濟南郊區(qū)曾出土過古蓮籽[3]，但并沒有被作為資源保存下來。此次梁山出土的蓮籽成功培育出苗在黃河流域尚屬首次。從出土蓮籽及古蓮植株的表型可以看出，古蓮群體內(nèi)有明顯的多樣性，暗示其遺傳多樣性比較豐富，可能蘊含一些重要的基因資源。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)梁山古蓮與山東省地方品種馬踏湖白蓮親緣關(guān)系較近，這為研究北方蓮藕的馴化和開展育種研究提供了重要信息。

綜上可見，梁山古蓮是重要的種質(zhì)資源，下一步將利用分子標(biāo)記技術(shù)對古蓮群體進行遺傳多樣性分析，并開展抗病等重要性狀的評價和基因挖掘。

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[7]尹靜靜，李效尊，陰筱，等.山東蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn.）種質(zhì)資源的RAPD 鑒定和遺傳多樣性分析[J].分子植物育種，2015，13（6）：1 323-1 328.

[8]王其超，張行言.中國荷花品種圖志[M].北京：中國林業(yè)出版社，2004：63-66.

[9]王新悅.荷花產(chǎn)業(yè)向多元化、精品化轉(zhuǎn)型[J].中國花卉園藝，2014（9）:32-35.