呂剛 ，魏林 ，梁志懷 ，張屹

（1.中南大學研究生院隆平分院，湖南長沙，410125；2.湖南省植物保護研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所）

蓮藕是我國的一種特色水生蔬菜，在我國已有3 000多a的栽培歷史。目前在我國很多地區(qū)，蓮藕栽培已成為農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效的重要方式。近年在整個蓮藕生長過程中，各類葉斑病病害發(fā)生日益嚴重，一定程度上制約了蓮藕產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中發(fā)生最為普遍的就是由半知菌亞門鏈格孢屬（Alternaria）真菌引起的蓮藕黑斑病或稱蓮藕褐紋病[1]。該病典型癥狀是在蓮葉上產(chǎn)生黑褐色病斑，發(fā)病后期病斑可連成一片，造成整片葉枯死，給蓮藕的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來重大影響。

目前，在防治蓮藕葉斑病上，登記的藥劑僅有丙環(huán)唑及多菌靈2種，單一使用某種或某幾種藥劑，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，更加不利于田間防治。本文通過對分離、純化獲得的目標病原菌進行了室內(nèi)毒力測定，篩選出毒力較強的藥劑，并將獲得的藥劑在蓮藕栽種田進行大田防治試驗，以期獲得對蓮藕鏈格孢葉斑病具有較好防效的化學藥劑。

1 材料與方法

1.1 病葉的采集及目標病原菌的獲得

鏈格孢葉斑病典型病葉采集于湖南長沙縣黃興鎮(zhèn)子蓮種植區(qū)，品種為寸三蓮。病原菌的分離采用組織分離法，待分離組織塊在PDA培養(yǎng)基上長出菌絲后，挑取菌絲進行純化培養(yǎng)，然后再對純化培養(yǎng)菌株進行單孢分離純化，獲得純培養(yǎng)物[2]。

1.2 病原菌形態(tài)觀察

將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7 d后觀察菌落形狀、顏色及菌絲疏密程度，并在顯微鏡下觀察其分生孢子形態(tài)并拍照保存，同時測量分生孢子的大小。根據(jù)分生孢子形態(tài)和大小，參照魏景超[4]的方法，初步確定病原屬種（關(guān)于具體種的確定另文發(fā)表）。

1.3 分離物致病性測定及再分離

根據(jù)柯赫氏法則，采用活體接種法，先將待接種的健康幼嫩、無斑點和褪綠癥狀的盆栽蓮藕葉片接種部位進行表面消毒，然后將分離純化的病原菌菌絲塊以針刺法接種于該部位，并用蘸水的無菌脫脂棉保濕。每個處理設置3次重復，并以無菌PDA培養(yǎng)基接種作為對照，待接種部位出現(xiàn)葉斑癥狀后，從癥狀病健交界處再次進行病原菌分離[3]。

1.4 供試化學藥劑對鏈格孢菌的室內(nèi)毒力測定

供試的化學藥劑及使用濃度見表1。

通過菌絲生長速率測定[5]，比較供試化學殺菌劑藥劑對葉斑病病原菌的室內(nèi)毒力。用無菌水將各藥劑配制成10 mg/mL的母液，再根據(jù)前期預備試驗結(jié)果，取定量的母液加入溫度40～50℃的無菌PDA三角瓶中，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿中，制成含不同供試濃度殺菌劑的平板備用。在平板中央接種一塊病原菌的菌餅，置于25℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不含藥劑的PDA平板為對照，各供試濃度設4個重復。待對照菌絲長滿培養(yǎng)基后，用游標卡尺十字交叉法測定各培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的直徑。

抑菌率（I，%）=[（D0-Dt）/D0]×100%，其中：I為菌絲生長抑制率，D0為對照菌落增長直徑，Dt為處理菌落增長直徑。其中D=D1-D2（D表示菌落增長直徑，D1表示菌落直徑，D2表示菌餅直徑）。

以藥劑濃度的對數(shù)為自變量X，以抑制率的機率值為因變量Y，運用Excel軟件進行統(tǒng)計分析，求出供試藥劑對病菌的毒力回歸方程Y=aX+b及相關(guān)系數(shù)（r）值，并由方程計算各供試藥劑的抑制中濃度（EC50）。

表1 供試化學藥劑及室內(nèi)毒力測定使用濃度

1.5 大田試驗

①施藥方法 根據(jù)室內(nèi)毒力測定結(jié)果，參照田間實際用藥情況，選取田間防治黑斑病的藥劑及使用濃度分別為50%多菌靈可濕性粉劑500倍液、40%氟硅唑乳油8 000倍液、25%丙環(huán)唑乳油3 000倍液和99%噁霉靈原藥4 000倍液。大田防治試驗在湖南懷化洪江藕蓮種植基地進行，該地藕田土壤肥力中等，各試驗藥劑小區(qū)面積約300 m2。施藥時為藕蓮生長的立葉期，此時田中黑斑病已普遍發(fā)生。施藥液量為40 kg/667 m2，以等量清水作為對照。共施藥3次，每次間隔7 d。第1次施藥前和最后1次施藥后7 d調(diào)查病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)計算各藥劑的防治效果。

②調(diào)查方法與防效計算 采用對角線五點取樣調(diào)查法，每點選取20～30片葉調(diào)查病情。病害分級標準為：0級：無病斑；1級：病斑面積占整片葉面積的10%及以下；3級：病斑面積占整片葉面積的11%～25%；5級：病斑面積占整片葉面積的26%～50%；7級：病斑面積占整片葉面積的51%～75%；9級：病斑面積占整片葉面積的75%及以上。按下面公式計算病情指數(shù)和防治效果[6]，病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×相對級值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100；防治效果（%）=[1-（CK0×Pt1）/（CK1×Pt0）]×100%； 其中 CK0為藥前對照組病情指數(shù)，CK1藥后對照組病情指數(shù)，Pt0為藥前處理組病情指數(shù)，Pt1藥后處理組病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢屬病原菌的獲得

初始菌株和再分離菌株在PDA上培養(yǎng)7 d后，菌落正面呈顏色均一的黑色，表面呈細茸狀，菌落背面略呈褐色，表面光滑（圖1、2）。顯微觀察表明，分生孢子褐色，呈倒棍棒狀，頂端延長，多細胞，有壁磚狀分隔（圖3、4）。

2.2 病原菌毒力測定

從表2中的EC50值可知，各藥劑對該病原菌的菌絲生長均有一定的抑制作用，其中40%氟硅唑乳油的抑菌效果最好，其EC50值為0.42 μg/mL，而25%醚菌酯懸浮劑的抑菌效果最低，其EC50值高達500.00 μg/mL。

2.3 大田試驗

選用室內(nèi)對蓮藕黑斑病菌菌絲生長抑制力較強的3個化學農(nóng)藥（多菌靈、氟硅唑和噁霉靈）以及在蓮藕上已經(jīng)登記的藥劑丙環(huán)唑，對黑斑病進行田間防治試驗，應用防效見表3。

圖1 鏈格孢屬病原菌的獲得與孢子形態(tài)

試驗結(jié)果表明，在田間黑斑病普遍發(fā)生的情況下，40%氟硅唑乳油和50%多菌靈可濕性粉劑對該病具有較好的防治效果，防效都達70%以上，25%丙環(huán)唑乳油的防效為62.67%，低于前兩者；而以前在蓮藕浮葉期撒施對黑斑病預防效果較好的99%噁霉靈原藥對該病的治療效果僅有46.19%。

表2 供試藥劑對黑斑病菌室內(nèi)毒力生測結(jié)果

表3 各藥劑大田試驗防治效果

3 討論與結(jié)論

交鏈孢屬真菌是一類常見的病原菌，可侵染葉片，引起植物各類葉斑病，如玉米交鏈孢葉枯病、棉花黑斑病、辣椒黑斑病等[7～9]。本試驗利用從藕田分離得到的交鏈孢病原菌菌株，進行了室內(nèi)毒力測定和大田試驗，篩選得到了對該菌株有較強毒力和良好田間防治效果的化學藥劑40%氟硅唑乳油和50%多菌靈可濕性粉劑。氟硅唑是一種三唑類的內(nèi)吸殺菌劑，具有保護和治療作用，滲透性強，是當前防治真菌性葉斑病的主要藥劑；而多菌靈作為一種廣譜高效低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，既是市場上廣泛使用的藥劑也是蓮藕上登記的藥劑，2個藥劑均容易獲得。二者與在蓮藕上另一登記藥劑——25%丙環(huán)唑乳油交替使用，防治蓮藕黑斑病，可以避免該病原菌產(chǎn)生抗藥性。前期試驗表明，99%噁霉靈原藥在對藕種浸種處理、浮葉期撒施土壤處理時對黑斑病均具有較好的預防效果，但在黑斑病發(fā)生較嚴重中，用該藥劑噴霧處理對黑斑病的治療效果卻并不理想。該試驗結(jié)果為藕農(nóng)田間施藥防治黑斑病提供更多了選擇和指導。

[1]丁自立，吳金平，刁英，等.蓮藕主要病害及其綜合防治[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（15）：3 078-3 079，3 082.

[2]方中達.植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007：122-145.

[3]劉昱鋒，張錚，馬銀峰.三葉木通葉斑病病原菌鑒定[J].植物保護，2013，39（2）：57-62.

[4]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海科學技術(shù)出版社，1979.

[5]柳鳳，詹儒林，韋繼光，等.杧果畸形病病菌（Fusarium mangiferae）生物學特性及殺菌劑對其室內(nèi)毒力測定[J].果樹學報，2012（3）：428-433.

[6]游文宇，梁艷東，蘇毅，等.250 g/L醚菌酯懸浮劑對不同地區(qū)馬鈴薯晚疫病的防治效果分析[J].中國馬鈴薯，2015，29（3）：167-170.

[7]張定法，張希福，郎劍鋒，等.玉米交鏈孢葉斑病病原菌鑒定及生物學特性[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（10）： 2 057-2 058.

[8]陳凱，劉愛榮，吳尚英，等.棉花黑斑病病原菌鑒定及生防木霉菌株的篩選[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（9）：1 793-1 796.

[9]李敏權(quán)，陳天仁，王華，等.辣椒黑斑病菌的室內(nèi)防效測定[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2002，37（2）：190-193.