呂剛 ，魏林 ，梁志懷，馬艷青 ，張屹

（1.中南大學(xué)研究生院隆平分院，長(zhǎng)沙，410125；2.湖南省植物保護(hù)研究所；3.湖南省西瓜甜瓜研究所；4.湖南省蔬菜研究所）

子蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）是我國(guó)的特色水生蔬菜之一，其果實(shí)——蓮籽可供食用、藥用，其花是中國(guó)十大名花之一，深受人們喜愛而廣泛種植[1]。湖南子蓮品種寸三蓮因其品質(zhì)優(yōu)良在清道光、光緒期間作為貢蓮，備受矚目。寸三蓮3顆蓮籽正好1寸（3.3 cm）長(zhǎng)，故稱寸三蓮，色白、營(yíng)養(yǎng)，100 g蓮籽的蛋白質(zhì)含量比雞蛋還高。湖南湘潭縣為寸三蓮的起源地，寸三蓮一直為當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)作物，得到大面積推廣種植。目前各寸三蓮種植戶一般都是自行留種進(jìn)行種植，種植戶之間存在多種寸三蓮品系或株系，品種比較混亂，給湘蓮市場(chǎng)和湘蓮品牌帶來了不利影響。因此很有必要對(duì)當(dāng)前混亂的湘蓮品種親緣關(guān)系進(jìn)行分子檢測(cè)分析，從分子水平上探索不同寸三蓮資源的遺傳差異，并最終獲得對(duì)寸三蓮典型品系341及其親緣關(guān)系很近的子蓮品種具較好識(shí)別作用的鑒定體系。

SRAP標(biāo)記，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）是一種基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li等[2]于2001年提出，又叫基于序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism SBAP）[2]。該標(biāo)記通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)ORF（open reading frames）進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物長(zhǎng) 17 bp，5'端前 10個(gè)堿基為“填充”序列（filler sequence），無任何特異組成，接著為CCGG序列，它們組成核心序列及3'端3個(gè)選擇性堿基，對(duì)外顯子進(jìn)行特異擴(kuò)增；下游引物長(zhǎng)18 bp，5'端前11個(gè)堿基為“填充”序列，緊接著是AATT，它們組成核心序列及3'端3個(gè)選擇性堿基，對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增。因個(gè)體不同以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)，并已被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)[3，4]和遺傳多樣性分析。

因此，以前期研究確定田間種植表現(xiàn)型優(yōu)秀、編號(hào)為341號(hào)的寸三蓮品種為典型品系，以寸三蓮原種場(chǎng)栽種的湖南湘潭縣內(nèi)101份寸三蓮種質(zhì)資源和21份太空蓮等子蓮品種為對(duì)比材料，應(yīng)用SRAP技術(shù)，對(duì)其鑒定體系進(jìn)行了試驗(yàn)研究，初步研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 子蓮樣品的采集

以湘蓮寸三蓮為主要研究對(duì)象，收集了包括典型品系341在內(nèi)的湖南湘潭縣寸三蓮品種資源102份，其中排頭鄉(xiāng)29份、龍口鄉(xiāng)16份、烏石鎮(zhèn)14份、石鼓鎮(zhèn)13份、白石鎮(zhèn)10份、中路鋪鎮(zhèn)10份、茶恩寺鎮(zhèn)6份、石潭壩鎮(zhèn)4份。另外還采集了外地品種廣昌蓮和贛蓮62號(hào)等外來引進(jìn)品種21份作為對(duì)比材料。

1.2 子蓮樣品的DNA提取

取子蓮幼嫩葉片，液氮研磨粉碎后提取DNA，具體方法：稱取1 g樣品液氮研磨至粉碎，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，再加入600 μL經(jīng)65℃預(yù)熱過的2.5%的 CTAB，65℃水浴 1 h，每隔10 min顛倒混勻一次；加入體積比為 25∶24∶1的酚∶氯仿∶異戊醇 600 μL，充分混勻，冰浴 10 min 后，4℃、12 000 r/min平衡離心20 min；取上清液至另一干凈的離心管中，加入500 μL冰冷的異丙醇，輕輕混勻，放入 4℃冰箱保存 30 min后，4℃、12 000 r/min平衡離心5 min；倒掉上清液，加入1 mL的無水乙醇清洗DNA，離心1 min，倒掉乙醇，晾干后加入50 μL ddH2O。提取結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)[5]。

1.3 引物篩選

為篩選出多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物組合，利用田間表現(xiàn)型鑒定出寸三蓮品種的典型品系 （編號(hào)為341號(hào)，來自于排頭鄉(xiāng)長(zhǎng)山黃見德）進(jìn)行SRAP標(biāo)記技術(shù)用的共計(jì)225對(duì)引物的篩選。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為12.5 μL，其中ddH2O7.05μL，DNA模板2μL，buffer 1.25 μL，dNTPs 1.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，Taq酶 0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，之后共35個(gè)循環(huán) ：94℃ 變 性 20 s，54℃ 退 火20 s，72℃延伸 30 s。最后 72℃延伸 7 min。PCR 產(chǎn)物通過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)進(jìn)行引物的篩選。

1.4 寸三蓮典型品系341分子標(biāo)記的確定

利用篩選出的多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物組合對(duì)所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.3。PCR產(chǎn)物通過8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，尋找能檢測(cè)出典型品系341的特異性標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 子蓮樣品DNA的提取

應(yīng)用1.2所述的方法，能獲得較好的樣品DNA，結(jié)果見圖1。

圖1 部分籽蓮樣品DNA提取結(jié)果電泳

表1 篩選出的引物序列

2.2 SRAP引物篩選

篩選出了16對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的引物 ME1+EM3；ME3+EM10；ME4+EM5；ME5+EM1；ME5+EM7；ME6+EM2；ME6+EM4；ME8+EM2；ME8+EM6；ME8+EM12；ME11+EM12；ME12+EM4；ME14+EM3；ME14+EM7；ME14+EM10；ME15+EM9，具體引物序列見表1。

2.3 獲得典型品系341的特異性分子標(biāo)記

利用篩選出的多態(tài)性較好引物組合進(jìn)行SRAP分析。其中上游引物ME6（5'-3'TGAGTCCAAACCGGACA）加下游引物 EM2（5'-3'GACTGCGTACGAATTTGC）的引物組合對(duì)341號(hào)有特異性擴(kuò)增,擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度在390 bp左右（圖2，3）。部分樣品來源如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，該特異性分子標(biāo)記除對(duì)典型品系341具有重復(fù)性很好的鑒別作用外，還對(duì)供試的123份樣品中其他12份樣品也擴(kuò)增出了條帶（樣品來源見表3）。溯源這些樣品在田中的表現(xiàn)型，發(fā)現(xiàn)它們的產(chǎn)量、花形、花色及對(duì)腐敗病的抗性等都與典型品系341相近。

表2 部分供試樣品來源

表3 具備341號(hào)相同特異性條帶的樣品

3 結(jié)論與討論

SRAP技術(shù)也已被應(yīng)用在蓮的遺傳研究上[6～8]。本試驗(yàn)利用SRAP技術(shù)，首先篩選得到了多組對(duì)寸三蓮品種典型品系341擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物組合，再將這些引物同其他101份樣品比較，獲得了ME6+EM2的特異性的分子標(biāo)記引物，典型品系341擴(kuò)增出一條約390 bp大小的特異性條帶。由于寸三蓮主要在湖南湘潭地區(qū)種植，具有較強(qiáng)的地域特性，品種之間遺傳距離小，導(dǎo)致區(qū)分難度加大。本試驗(yàn)開發(fā)的ME6+EM2分子標(biāo)記，獲得了特異性較高的擴(kuò)增片段，可以作為品種鑒定的輔助手段，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)，擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好，可以區(qū)分親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種，較大限度地識(shí)別寸三蓮的典型品系。但是，由于所獲得的特異性片段為非主擴(kuò)增帶，難以識(shí)別親緣關(guān)系很近的品種，當(dāng)品種間親緣關(guān)系較近時(shí)，識(shí)別難度加大。如在本試驗(yàn)中，在供試的123份樣品中還有其他12份樣品也擴(kuò)增出了與典型品系341一致的特異性條帶，而分析表明，這12份樣品在田中的表現(xiàn)型都與341相近，這可能是由于這些材料與典型品系341有較近的親緣關(guān)系所致。所以為穩(wěn)定湘蓮市場(chǎng)，打造湘蓮品牌，分子手段可以作為一種輔助手段，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)，還應(yīng)該考慮品種的來源并結(jié)合田間栽培的表現(xiàn)型進(jìn)行鑒定。

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